Fluorescence quantitative PCR (fantatra ihany koa amin'ny hoe TaqMan PCR, antsoina hoe FQ-PCR) dia teknolojia fatran'ny asidra nukleika vaovao novolavolain'ny PE (Perkin Elmer) tany Etazonia tamin'ny taona 1995. Ity teknolojia ity dia mifototra amin'ny PCR mahazatra amin'ny alàlan'ny fampidirana probes misy marika fluorescent.Raha ampitahaina amin'ny PCR malefaka, ny FQ-PCR dia manana tombony maro amin'ny fanatanterahana ny asany.Ity lahatsoratra ity dia mikasa ny hamaritra fohifohy ny toetra, ny fitsipika, ny fomba ary ny fampiharana ny teknolojia.
1 Toetra
Ny FQ-PCR dia tsy manana ny fahatsapana avo lenta amin'ny PCR tsotra, fa koa noho ny fampiharana ny fluorescent probes, dia afaka mahita mivantana ny fiovan'ny fluorescent famantarana mandritra ny fanamafisana ny PCR amin'ny alàlan'ny rafi-pandrefesana photoelectric mba hahazoana vokatra be dia be, izay maharesy ny lesoka maro amin'ny PCR mahazatra, noho izany dia manana ny mari-pamantarana avo lenta amin'ny teknolojia ADN sy ny spectroscopy avo lenta.
Ohatra, ny vokatra PCR ankapobeny dia mila jerena amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel agarose sy ny fandokoana ethidium bromide amin'ny hazavana ultraviolet na amin'ny electrophoresis gel polyacrylamide sy fandokoana volafotsy.Izany dia tsy mitaky fitaovana maro, fa mitaky fotoana sy ezaka ihany koa.Ny tasy ampiasaina Ethidium bromide dia manimba ny vatan'olombelona, ary ireo fomba andrana sarotra ireo dia manome fahafahana handoto ny loto sy ny vokatra diso.Na izany aza, FQ-PCR ihany no mila manokatra ny sarony indray mandeha mandritra ny santionany loading, ary ny dingana manaraka dia tanteraka mihidy-Tube fandidiana, izay tsy mitaky PCR post-processing, fisorohana ny maro drawbacks amin'ny mahazatra PCR asa.Ny fanandramana amin'ny ankapobeny dia mampiasa ny cycler thermal ABI7100 PCR novolavolain'ny orinasa PE.
Ny fitaovana dia manana ireto toetra manaraka ireto: ① Fampiharana midadasika: Azo ampiasaina amin'ny fanombanana ny vokatra ADN sy RNA PCR, fikarohana fanehoana ny fototarazo, fitadiavana pathogen, ary fanatsarana ny fepetra PCR.② Fitsipika tokana tsy manam-paharoa: Amin'ny fampiasana probe misy marika fluorescently, ny habetsaky ny fluorescence dia hiangona miaraka amin'ny tsingerin'ny PCR aorian'ny fientanentanana tamin'ny laser, mba hahatratrarana ny tanjon'ny quantification.③ Fahombiazan'ny asa avo lenta: cycler thermal 9600 PCR naorina, fehezin'ny ordinatera 1 ka hatramin'ny 2 ora mba hamitana ny fanamafisam-peo sy ny fanombanana ny santionany 96 mandeha ho azy sy synchronously.④ Tsy ilaina ny gel electrophoresis: Tsy ilaina ny manalefaka sy ny electrophoresis ny santionany, mampiasa probe manokana mba hamantarana mivantana ao amin'ny fantsona fanehoan-kevitra.⑤Tsy misy loto ao amin'ny fantsona: Ny fantsona fanehoan-kevitra tsy manam-paharoa feno sy ny rafi-pitaterana photoelectric dia raisina, ka tsy mila manahy momba ny loto.⑥Ny vokatra dia azo averina: ny isan-karazany dynamique fatrany dia hatramin'ny dimy litatra ny habeny.Noho izany, hatramin'ny nahavitan'io teknolojia io tamim-pahombiazana, dia nanome lanja azy ny mpikaroka siantifika maro ary nampiharina tamin'ny sehatra maro.
2 Fitsipika sy fomba
Ny fitsipiky ny fiasan'ny FQ-PCR dia ny fampiasana ny hetsika exonuclease 5′→3′ an'ny Taq enzyme mba hanampiana probe misy marika fluorescently amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR.Ny probe dia afaka mitambatra manokana amin'ny maodely ADN voarakitra ao amin'ny filaharana voalohany.Ny 5′end amin'ny probe dia misy marika miaraka amin'ny FAM (6-carboxyfluorescein, tampon'ny emission fluorescence amin'ny 518nm), ary ny 3′end dia misy marika miaraka amin'ny The fluorescence quenching group TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence emission peak amin'ny 582 emission peak amin'ny 582 ny tampon'ny fluorescence amin'ny phosphorus 3. ny probe tsy hitarina mandritra ny PCR amplification.Rehefa mijanona ho tsy misy dikany ny probe, ny vondrona quencher dia manafoana ny famoahana fluorescence amin'ny vondrona mamoaka.Raha vantany vao tafasaraka amin'ny vondrona famonoana ny vondrona mamoaka, dia esorina ny fanakanana, ary mitombo ny hakitroky optika amin'ny 518nm ary tsikaritry ny rafi-pandrefesana fluorescence.Rehefa tapaka ny probe dia mivoaka ny effet quenching ary mivoaka ny signal fluorescent.Isaky ny adika ny môdely dia tapaka ny probe iray, miaraka amin'ny famoahana famantarana fluorescent.Koa satria misy fifandraisana tokana eo amin'ny isan'ny fluorophores navoaka sy ny isan'ny vokatra PCR, ity teknika ity dia azo ampiasaina hamaritana tsara ny môdely.Ny fitaovana andrana amin'ny ankapobeny dia mampiasa ny cycler thermal ABI7100 PCR novolavolain'ny orinasa PE, ary azo ampiasaina koa ny cyclers thermal hafa.Raha ny rafitra fanehoan-kevitra karazana fanehoan-kevitra ABI7700 no ampiasaina amin'ny andrana, rehefa vita ny fanehoan-kevitra, dia azo omena mivantana amin'ny alalan'ny famakafakana solosaina ny valim-pifidianana.Raha mampiasa mpitaingina mafana hafa ianao dia mila mampiasa mpitsikilo fluorescence mba handrefesana ny famantarana ny fluorescence ao amin'ny fantsona fanehoan-kevitra miaraka amin'ny kajy RQ +, RQ-, △RQ.RQ + dia maneho ny tahan'ny ny luminescence hamafin'ny fluorescent emission vondrona ny santionany fantsona ny luminescence hamafin'ny vondrona famonoana, RQ- dia maneho ny tahan'ny roa ao amin'ny banga fantsona, △RQ (△RQ = RQ + -RQ-) maneho ny habetsahan'ny fluorescence famantarana fiovana nandritra ny PCR Rehefa avy ny angon-drakitra fanodinana dia azo atao quantitative vokatra.Noho ny fampidirana ny fluorescent probes, ny specificity ny fanandramana dia nihatsara be.Ny famolavolana probe amin'ny ankapobeny dia tokony mahafeno ireto fepetra manaraka ireto: ①Ny halavan'ny probe dia tokony ho eo amin'ny 20-40 fototra mba hahazoana antoka ny maha-tokana ny famatorana.②Ny votoatin'ny fototra GC dia eo anelanelan'ny 40% sy 60% mba hisorohana ny dika mitovy amin'ny filaharan'ny nucleotide tokana.③ Fadio ny hybridization na mifanindry amin'ny primers.④ Ny fahamarinan'ny fifamatorana eo amin'ny probe sy ny môdely dia lehibe kokoa noho ny fahamarinan'ny fifamatorana eo amin'ny primer sy ny môdely, noho izany dia tokony ho 5 ° C fara fahakeliny ny sandan'ny Tm an'ny probe raha oharina amin'ny sanda Tm an'ny primer.Ankoatr'izay, ny fifantohan'ny probe, ny homolojia eo amin'ny probe sy ny filaharan'ny môdely, ary ny halaviran'ny probe sy ny primer dia misy fiantraikany amin'ny vokatra andrana.
Vokatra mifandraika:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Manufacturer and Supplier |Foregene (foreivd.com)
Fotoana fandefasana: Oct-15-2021
