1. Fantaro ny fidiran'ny vahaolana ARN
Ny absorbance amin'ny 280, 320, 230, ary 260 nm dia maneho ny soatoavin'ny asidra nukleika, ny fiaviana (fahoriana vahaolana), ny fifantohan'ny sira, ary ny zavatra organika toy ny proteinina.Amin'ny ankapobeny dia jereo fotsiny ny OD260/OD280 (Ratio, R).Rehefa 1.8 ~ 2.0 dia heverintsika fa azo leferina ny fandotoana proteinina na zavatra organika hafa ao amin'ny ARN, saingy tokony ho marihina fa rehefa ampiasaina ho buffer ny Tris hamantarana ny absorbance, dia mety ho lehibe kokoa noho ny 2 ny sanda R (amin'ny ankapobeny dia tokony <2.2).Rehefa R<1.8, ny fandotoana ny proteinina na zavatra organika hafa ao amin'ny vahaolana dia miharihary kokoa, ary ny anjaran'ny ARN dia azo faritana araka ny filana.Rehefa R>2.2, dia midika izany fa ny ARN dia voahidy ho asidra nokleika tokana.
2. Electrophoretic modely ny ARN
Amin'ny ankapobeny, ny gel denaturation dia ampiasaina amin'ny electrophoresis RNA, fa raha mba hamantarana ny kalitaon'ny ARN ihany, dia tsy ilaina ny gel denaturation, ary azo ampiasaina ny gel agarose mahazatra.Ny tanjon'ny electrophoresis dia ny hamantatra ny fahamendrehan'ny tarika 28S sy 18S sy ny tahan'izy ireo, na ny fahamendrehan'ny smear mRNA.Amin'ny ankapobeny, raha mamiratra sy mazava ary maranitra ny tarika 28S sy 18S (manondro ny sisin'ny tarika dia mazava), ary ny famirapiratry ny 28S dia mihoatra ny avo roa heny noho ny tarika 18S, dia heverinay fa tsara ny kalitaon'ny ARN.
Ireo fomba roa ireo no ampiasaina matetika, saingy tsy misy amin'ireo fomba roa ireo afaka milaza mazava amintsika raha misy RNase sisa ao amin'ny vahaolana RNA.Raha kely dia kely ny RNase amin'ny vahaolana, dia sarotra ho antsika ny mamantatra izany amin'ny fomba etsy ambony, fa ny ankamaroan'ny fanehoan-kevitra enzymatic manaraka dia atao amin'ny 37 degre ambony ary mandritra ny fotoana maharitra.Amin'izany fomba izany, raha misy RNase kely dia kely ao amin'ny vahaolana RNA, dia hisy tontolo sy fotoana tena mety amin'ny anjara asany amin'ny andrana manaraka, ary mazava ho azy fa mangatsiaka ny fanandramana amin'izao fotoana izao.Ity ambany ity dia manolotra fomba iray izay afaka manamarina raha misy RNase sisa ao amin'ny vahaolana RNA.
3. Fitsapana fitehirizana hafanana
Araka ny fifantohana santionany, manaova RNA 1000 ng roa avy amin'ny vahaolana RNA ary ampio amin'ny fantsona centrifuge 0,5 ml, ary ampio amin'ny buffer pH 7.0 Tris amin'ny totalin'ny 10 ul, ary asio tombo-kase ny satrony.Ataovy ao anaty rano fandroana amin'ny hafanana 70°C ny iray amin'izy ireo ary ataovy mafana mandritra ny 1 ora.Ny ampahany hafa dia voatahiry ao amin'ny vata fampangatsiahana -20 ° C mandritra ny 1 ora.Rehefa tapitra ny fotoana, esory ny santionany roa ho an'ny electrophoresis.Rehefa vita ny electrophoresis dia ampitahao ny tarika electrophoretic amin'ny roa.Raha mifanaraka na tsy misy fahasamihafana lehibe ny tadin'ny roa (mazava ho azy fa mifanaraka amin'ny fepetra ao amin'ny fomba 2 ihany koa ny tarika misy azy), dia midika izany fa tsy misy fandotoana RNase sisa amin'ny vahaolana RNA, ary ny kalitaon'ny ARN dia tena tsara.Mifanohitra amin'izany, raha ny santionany incubated amin'ny 70 ° C mampiseho ny fahasimbana miharihary, dia manondro fa misy RNase fandotoana ao amin'ny RNA vahaolana.
2 Fomba fanandramana sy teknika momba ny fitrandrahana RNA
Ny olana atrehantsika matetika rehefa maka RNA dia: (1) ambany ny vokatra ARN;2) Ny ARN dia misy fandotoana sira lehibe;(3) Ny ARN dia manana fahalotoana lehibe amin'ny solvent organika;(4) fanimbana santionany sy olana hafa
1. Reagents fitrandrahana RNA totalina ampiasaina matetika
Ny fomba guanidine isothiocyanate sy ny fomba Trizol no fomba fampiasa matetika indrindra amin'ny fitrandrahana ny totalin'ny RNA avy amin'ny tavy biby sy ny sela biby.Izy io dia mety indrindra ho an'ny santionany kely sy tavy izay sarotra indrindra ny alaina, toy ny fitrandrahana ny totalin'ny RNA avy amin'ny hoditry ny bitro sy ny tadin'ny biby;Ankoatra izany, Trizol, ho toy ny tanjona ankapobeny lysis reagent, dia azo ampiasaina amin'ny fitrandrahana ny zavamaniry sela, bakteria, holatra sy ny hafa.Ho an'ny vatan'ny zavamaniry misy polysaccharides sy polyphenols, toy ny camellia oleifera, ravin-dite, fanolanana, sns., dia azo ampiasaina ihany koa ny fomba CTAB hanesorana ny ARN manontolo.
Amin'ny maha fomba mahazatra, ny fomba tsanganana roa koa dia malaza be noho ny fiasan'ny mari-pana mahazatra, tsy ilaina ny manampy RNase, ary ny fiarovana-tsy misy chloroform, phenols ary reagents organika hafa ho an'ny fitrandrahana.(vokatra atolotra )
2. Ny fitrandrahana ny totalin'ny RNA avy amin'ny tavy biby
(1) Miezaha hisafidy tavy vaovao, raha tsy vaovao (tsara indrindra ao anatin'ny telo volana - 80 ℃ vata fampangatsiahana na mangatsiaka amin'ny ranon-javatra azota. Rehefa manapaka tavy, aza manapaka mivantana amin'ny efitrano mari-pana, aoka ho azo antoka ny hametraka izany eo amin'ny gilasy boaty, miezaka mba tsy miverimberina ny hatsiaka sy ny thawing.
(2) Mampiasà hety madio sy tsipìka mba hanapahana tapa-tavy kely iray, andramo manapaka ny tapany afovoany amin’ny tavy rehefa manapaka ilay santionany, na tapaho aloha ilay tapa-damba lehibe avy eo afovoany, ary avy eo dia tapaho ilay santionany eo amin’ny toerana misy tsindrona vaovao.Ny tavy nesorina dia tokony hosasana tanteraka, apetraho ao anaty tavoahangy EP tsy misy RNase ny tavy voatoto, ampio ny lysate, ny tavy voapotsitra dia tokony hiharihary tanteraka amin'ny lysate, ary miomana amin'ny homogenization.
(3) Ho an'ny tavy mahazatra, mifidiana tavy mirefy tsaramaso mung (30-60 mg) ho an'ny homogenization.Raha misy proteinina, tavy, na tavy matevina toy ny aty ny tavy, dia ampitomboy na ahena araka ny tokony ho izy ny habetsaky ny tavy tapaka (tsy voatery) Mifidiana 10 ~ 20 mg).
(4) Raha alaina ny hozatry ny trondro, ny henan'ny makamba, ny jellyfish ary ny tavy hafa misy rano be dia be, dia tokony hampitomboina araka ny tokony ho izy ny habetsaky ny santionany (100-200 mg no soso-kevitra).
(5) Raha mamela ny toe-javatra, dia azo esorina mivantana ny vatan'ny biby aorian'ny homogenized miaraka amin'ny homogenizer homogenika avo lenta, raha tsy misy fitaovana toy izany.
(6) Ny ARN azo aorian'ny fitrandrahana farany dia tsy maintsy apetraka eo amin'ny boaty ranomandry avy hatrany mba hampihenana ny fahasimban'ny ARN.
3. Ny fitrandrahana RNA sela biby
(1) sela fampiatoana: centrifuge mivantana ary ario ny antonony, sasao amin'ny sterile PBS in-1-2, avy eo miato amin'ny mety habetsahan'ny PBS, ary avy eo dia ampio lysate ho lysis.Aza asiana lysate mivantana any amin'ireo sela mipoitra rehefa avy nariana tanteraka ilay rano.Izany dia hahatonga ny fonosana histone navoaka taorian'ny sela lysed eo amin'ny sosona ivelany hifikitra amin'ny ivelan'ny sela mitete, ka hamerana ny fifandraisana amin'ny sela ao anatin'ny pellet amin'ny lysate., ka miteraka lysis sela tsy feno ary mihena ny vokatra RNA.
(2) Ny sela semi-adherent na tsy mifikitra mafy: Rehefa avy nariana ny fitaovana dia sasao amin'ny PBS in-1-2, avy eo dia atsofoka mivantana amin'ny habetsaky ny PBS ary tsofina amin'ny pipette na basy ny lovia kolontsaina mba hitsoka ny sela, ary hafindra any amin'ny sela tsy misy ARN.Ampio ny lysate amin'ny fantsona EP an'ny enzyme ho fitrandrahana.
(3) Ny sela miraikitra: mila levonina amin'ny trypsin aloha, avy eo angonina ao anaty fantsona EP tsy misy RNase, atao centrifuges mba hanesorana ny supernatant, voasasa in-1-2 amin'ny PBS mba hanesorana ny trypsin be loatra, ary averina amin'ny habetsaky ny PBS sahaza Avy eo dia miroso amin'ny dingana fitrandrahana.
4. Ny fitrandrahana RNA amin'ny zavamaniry
Ny vatan'ny zavamaniry dia manankarena amin'ny fitambarana fenolika, na manankarena polysaccharides, na misy metabolites faharoa tsy fantatra, na manana hetsika RNase avo lenta.Ireo akora ireo dia mitambatra tsara amin'ny ARN aorian'ny lysis sela mba hamorona complexes tsy mety levona na colloidal precipitates, izay sarotra esorina.Noho izany, rehefa maka ny vatan'ny zavamaniry isika, dia mila mifidy kitapo ho an'ny zavamaniry.Ny lysate ao amin'ny kitapo dia afaka mamaha tsara ny olana amin'ny oksizenina mora amin'ny polyphenols sy ny fisarahana ny polysaccharide sy ny asidra nucleic.
(Ho an'ny fitrandrahana RNA polysaccharide polyphenol plant, vokatra atolotra:
(1) Ny hodiny, ny pulp, ny voa, ny ravina, sns. amin'ny zavamaniry dia tokony hototoina tanteraka ao anaty laona.Mandritra ny fikosoham-bary dia tokony hameno ny azota ranon-javatra ara-potoana mba tsy hiempo ny santionany.Ny santionan'ny tany dia tokony hampidirina haingana amin'ny lysate ary hozongozonina mba hisorohana ny fahasimban'ny ARN.
(2) Ho an'ny santionany manankarena fibre toy ny vary sy ravina varimbazaha, tokony hahena araka ny tokony ho izy ny habetsaky ny fitrandrahana, raha tsy izany dia tsy ho tanteraka ny fikosoham-bary sy ny lysis, ka miteraka ambany ny vokatra azo avy amin'ny ARN.
(3) Ho an'ny vatan'ny zavamaniry misy rano be dia be, toy ny voankazo ampongabendanitra, voankazo pastèque, voankazo paiso, sns., Tokony hampitomboina araka ny tokony ho izy ny haben'ny santionany (100-200 mg dia tsy voatery).
(4) Ny vatan'ny zavamaniry, toy ny ravin-javamaniry, rhizomes, voankazo mafy ary fitaovana hafa dia aroso amin'ny fampiasana azota ranon-javatra mba hametahana tsara ny akora ao anaty laona, ary avy eo dia miroso amin'ny dingana fitrandrahana.Mety tsy hahomby amin'ny fanamafisana ny vatan'ny zavamaniry ny homogenizers mahazatra, ary tsy soso-kevitra amin'ny ankapobeny.
5. Tandremo momba ny fitrandrahana RNA
(1) Tokony ho vaovao araka izay azo atao ny santionany amin'ny tavy mba hisorohana ny fanala miverimberina sy ny fanalefahana.
(2) Tokony hototoina tanteraka ny tavy mandritra ny fitrandrahana, ary tsy tokony ho kely loatra ny tavy, mainka fa be loatra.
(3) Ny fotoana incubation ampy dia tokony homena aorian'ny fampidirana ny lysate mba hamenoana tanteraka ny santionany.
(4) Rehefa mampiasa ny fomba Trizol ho an'ny fitrandrahana, ny fitsipiky ny mitroka ny supernatant aorian'ny stratification dia "aleo kokoa ny mifoka rivotra kely noho ny mifoka rivotra bebe kokoa", ary tsy tokony hanesorana ny afovoany sosona, raha tsy izany dia hiteraka fandotoana ADN lehibe genomic.
(5) Rehefa manasa, ny ranon-javatra fanasan-damba dia tokony hiditra tanteraka manodidina ny rindrin'ny fantsona mba hiantohana ny fanasana tsara.
(6) Ho an'ny fomba fitrandrahana tsanganana, ankoatry ny fanesorana ny tsanganana aorian'ny fanasana, ny tsanganana adsorption dia tokony hapetraka ao anaty dabilio ultra-madio ary tsofina mandritra ny 5-10 minitra mba hamongorana tanteraka ny solvent organika ho maina.
(7) Amin'ny elution farany amin'ny fomba tsanganana, aorian'ny fampidirana ny rano DEPC, dia tokony hikolokolo mandritra ny 3-5 minitra, na ny rano DEPC dia tokony hafanaina amin'ny 60 ° C mialoha mba hampitombo ny vokatra elution.Ao amin'ny fomba nentim-paharazana Trizol cleavage sy isopropanol rotsak'orana, ny farany ARN dia levona ao amin'ny DEPC rano, noho izany dia tokony homena fotoana mety ho famongorana, ary ny farany ambany ny centrifuge fantsona dia tokony ho notsofina tsy tapaka amin'ny pipette tip.
3 Ttelo Antony sy vahaolana amin'ny fihenan'ny ARN / ratsy kalitao
1. Ambany loatra ny vokatra
Ny santionany nalaina dia ambany loatra, ny totalim-bidy dia tsy ampy, na ny santionany nalaina dia be loatra ary tsy feno ny lysis;ny tavy na ny sela manana kalitao mety dia tokony hampiasaina amin'ny fitrandrahana, ny fitsaboana mialoha ny santionany dia tsy maintsy atao tsara, ary ny lysis dia tokony ho ampy.
2. Sisan'ny genome
Rehefa misintona amin'ny fomba Trizol, rehefa atsofoka ao amin'ny sosona afovoany ny supernatant aorian'ny fametahana, dia hiteraka fandotoana genome lehibe;tokony ho fitandremana fanampiny rehefa manao layering mba tsy hitsoaka ny sosona afovoany.Raha ny fomba tsanganana no ampiasaina amin'ny fitrandrahana, ny kitapo misy DNase I dia azo fidina ho fitrandrahana.Levonina mivantana miaraka amin'ny DNase I ny asidra nokleika mipetaka eo amin'ny membrane, izay mety hampihena be ny adin'ny ADN.
3. Fanimbana ARN
Mety ho ny fahasimban'ny santionany nalaina mihitsy, na ny fahasimbana nateraky ny dingan'ny fitrandrahana;araka izay azo atao, ny santionany vaovao dia tokony hampiasaina amin'ny fitrandrahana RNA, ary ny santionany voaangona dia tokony hotehirizina ao amin'ny vata fampangatsiahana ranon-javatra na -80 ° C ara-potoana, ary tokony hialana amin'ny hatsiaka sy ny fandoroana miverimberina.Ny toro-hevitra maimaim-poana RNase / DNase, fantsona centrifuge ary fitaovana hafa dia tokony hampiasaina amin'ny fizotran'ny fitrandrahana RNA.Tokony ho haingana araka izay azo atao ny fizotran'ny fitrandrahana.Ny ARN nalaina dia tokony hapetraka amin'ny boaty gilasy ary tehirizina amin'ny -80 ara-potoana.Raha mila tsikaritra amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel ny ARN nalaina, dia tokony hatao avy hatrany ny electrophoresis aorian'ny fitrandrahana, ary tokony hosoloina ny buffer electrophoresis amin'ny iray vao voaomana.
4. Sisa sy solvent organika sisa tavela
Misy sira phenol sy guanidine ao amin'ny reagents, ary misy ethanol ny vahaolana fanadiovana.Nandritra ny dingan'ny fitrandrahana, ny lysate dia tsy nesorina tanteraka ary nariana, ary ny vahaolana fanasan-damba dia tsy maina tanteraka.Ny sira sisa tavela sy ny solvent organika dia manimba ny transcription mivadika sy ny PCR manaraka.Ny ambaratonga samihafa amin'ny fanakanana, noho izany dia tokony hesorina tanteraka ny lysate tavy mandritra ny dingan'ny fitrandrahana, ary ny fanasana dia tokony ho ampy mba hanasana ny rindrina manodidina ny fantsona.Ankoatra izany, ny fantsona dia foana sy tsofina dia dingana ilaina, izay hampihena bebe kokoa ny sisa amin'ny zavatra organika.
Raha mila fanazavana fanampiny momba ny fitrandrahana RNA dia araho azafady ny tranokalanay:
www.foreivd.com raha mila fanazavana fanampiny.
Fotoana fandefasana: Dec-01-2022
