Amin'ny maha-vaovao azy ao amin'ny laboratoara, dia tsy asa tsara ny manara-maso ireo zavamaniry tsara avy amin'ny andian-javamaniry manana tahan'ny fiovam-po ambany.Voalohany, ny ADN dia tsy maintsy alaina tsirairay avy amin'ny santionany maro, ary avy eo dia ho hitan'ny PCR ny fototarazo vahiny.Na izany aza, ny valiny dia matetika banga sy bandy miaraka amin'ny singa vitsivitsy indraindray, saingy tsy azo atao ny mamaritra raha misy tsy hita na fahitana diso..Tena tsy afa-manoatra ve ny miatrika dingana sy vokatra andrana toy izany?Aza manahy fa mampianatra anao ny fomba fisavana ireo zavamaniry tsara transgenika mora sy marina ny rahalahy.

Dingana 1

Design detection primers

Farito ny fototarazo endogenous sy ny fototarazo exogenous ho hita araka ny santionany hotsapaina, ary mifidiana solontena 100-500bp filaharana ao amin'ny fototarazo ho an'ny famolavolana primer.Ny primer tsara dia afaka miantoka ny fahamarinan'ny valim-pikarohana ary manafohy ny fotoana fitiliana (jereo ny appendice ho an'ny primers fitiliana fampiasa matetika).

Fanamarihana: Ny primers vao noforonina dia mila manatsara ny toetry ny fanehoan-kevitra ary manamarina ny fahamendrehana, ny fahitsiana ary ny fetran'ny fitiliana alohan'ny fisavana lehibe.

Dingana 2

Mamorona protocol experimental

Fanaraha-maso tsara: Ampiasao ny ADN voadio misy ny sombintsombiny kendrena ho lasitra hamaritana raha ara-dalàna ny rafi-pandrefesana PCR sy ny fepetra.

Fanaraha-maso ratsy / banga: Ampiasao ny môdely ADN na ddH2O izay tsy ahitana ny sombintsombiny kendrena ho môdely hahitana raha misy loharanon'ny loto ao amin'ny rafitra PCR.

Fanaraha-maso anatiny: ampiasao ny fitambaran'ny fototarazo endogenous amin'ny santionany ny fitambaran'ny primer/probe mba hotsapaina raha mety ho hitan'ny PCR ilay môdely.

Fanamarihana:

Ny fanaraha-maso tsara, négatif/blank ary ny fanaraha-maso anatiny dia tokony apetraka isaky ny fitsapana mba hanombanana ny fahamarinan'ny valin'ny andrana.

Fiomanana andrana

Alohan'ny hampiasana dia diniho raha mifangaro tsara ny vahaolana.Raha hita ny rotsak'orana dia mila levona sy afangaro araka ny toromarika alohan'ny fampiasana.Ny fangaro 2×PCR dia mila atao pipette ary afangaro imbetsaka amin'ny micropipette alohan'ny hampiasana azy mba hialana amin'ny fitsinjarana ion tsy mitovy.

Fanamarihana:

Esory ny boky ary vakio tsara, ary manaova fiomanana alohan'ny andrana mifanaraka tsara amin'ny fepetra takian'ny boky.

Dingana 4

Manomana rafitra fanehoan-kevitra PCR

Araka ny protocole andrana, afangaro ny primers, H2O, ary 2×PCR afangaro mitovy, centrifuge ary zarao amin'ny fantsona fanehoan-kevitra tsirairay.

Fanamarihana:

Ho an'ny fitsapana lehibe na maharitra, dia asaina mampiasa rafitra fanehoan-kevitra PCR misy enzyme UNG, izay afaka misoroka ny fandotoana aerosol vokatry ny vokatra PCR.

Dingana 5

Ampio modely fanehoan-kevitra

Amin'ny fampiasana ny teknolojia Direct PCR, tsy ilaina ny fanadiovana asidra nokleika mandreraka, ny modely santionany dia azo omanina ao anatin'ny 10 minitra, ary azo ampiana ny rafitra fanehoan-kevitra PCR mifanaraka amin'izany.

Fanamarihana:

Ny fomba cleavage dia manana fiantraikany tsara kokoa, ary ny vokatra azo dia azo ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra marobe.

5.1: Miitatra mivantana ny ravina

Araka ny haben'ny sary ao amin'ny boky torolalana, tapaho ny tavy ravina misy savaivony 2-3mm ary apetraho ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR.

Fanamarihana: Ataovy azo antoka fa miroboka tanteraka amin'ny vahaolana PCR ny sombin-dravina, ary aza asiana tavy be loatra.

5.2: Fomba fisarahana ravina

Hetezo ny tavy ravina misy savaivony 5-7mm ary apetraho ao anaty fantsona centrifuge.Raha misafidy ravina matotra ianao dia aza mampiasa ny tadin'ny lalan-dravina lehibe.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ao anaty fantsona centrifuge mba hahazoana antoka fa ny lysate dia afaka mandentika tanteraka ny tadin'ny ravina, apetraho ao anaty cycler mafana na fandroana metaly, ary lyse amin'ny 95 ° C mandritra ny 5-10 minitra.

Ampio 50ul Buffer P2 neutralization vahaolana ary afangaro tsara.Ny lysate vokatr'izany dia azo ampiasaina ho modely ary ampiana amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR.

Fanamarihana: Ny habetsaky ny môdely dia eo anelanelan'ny 5-10% amin'ny rafitra PCR, ary tsy tokony hihoatra ny 20% (ohatra, amin'ny rafitra PCR 20μl, ampio 1-2μl ny vahaolana lysis, tsy mihoatra ny 4μl).

Dingana 6

PCR fanehoan-kevitra

Taorian'ny centrifuging ny PCR fanehoan-kevitra fantsona, dia apetraka ao amin'ny PCR fitaovana mba hanamafisana.

Fanamarihana:

Ny fanehoan-kevitra dia mampiasa môdely tsy voadio ho an'ny amplification, noho izany ny isan'ny tsingerin'ny fanamafisam-peo dia tsingerina 5-10 bebe kokoa noho ny rehefa mampiasa môdely ADN voadio.

Dingana 7

Fikarohana electrophoresis sy famakafakana vokatra

M: Tohatra ADN 100bp

1\4: Fomba ADN voadio

2\5: Fomba PCR mivantana

3\6: Fanaraha-maso banga

QC:

Ny valin'ny fitsapana amin'ny fanaraha-maso isan-karazany napetraka ao amin'ny andrana dia tokony hahafeno ireto fepetra manaraka ireto.Raha tsy izany, ny antony mahatonga ny olana dia tokony hodinihina, ary ny fitsapana dia tokony hatao indray rehefa afaka ny olana.

Tabilao 1. Valin'ny fitsapana mahazatra amin'ny vondrona mpanara-maso isan-karazany

*Rehefa ampiasaina ho fanaraha-maso tsara ny plasmid, dia mety ho ratsy ny valin'ny fitsapana fototarazo endogenous

Vokany fitsarana:

A. Ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo endogen ao amin'ny santionany dia ratsy, izay manondro fa ny ADN mety amin'ny fitiliana PCR mahazatra dia tsy azo esorina amin'ny santionany na ny ADN nalaina dia misy inhibitory fanehoan-kevitra PCR, ary ny ADN dia tokony alaina indray.

B. Ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo endogenous amin'ny santionany dia tsara, ary ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo exogenous dia ratsy, izay manondro fa ny ADN mety amin'ny fitiliana PCR mahazatra dia nalaina avy amin'ny santionany, ary azo tsaraina fa ny XXX dia tsy hita ao amin'ny santionany.

C. Ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo endogen ao amin'ny santionany dia tsara, ary ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo exogenous dia tsara, izay manondro fa ny ADN mety amin'ny fitiliana PCR mahazatra dia nalaina tamin'ny santionany, ary ny ADN santionany dia misy ny fototarazo XXX.Azo atao bebe kokoa ny fanandramana fanamafisana.

Dingana 8

Design detection primers

Aorian'ny fanandramana, ampiasao ny vahaolana 2% ny sodium hypochlorite sy ny vahaolana ethanol 70% mba hamafa ny faritra andrana mba hisorohana ny fandotoana ny tontolo iainana.