Ny transcriptases mivadika nentim-paharazana dia tsy afaka mandefitra ny mari-pana ambony (ny mari-pana tsara indrindra ho an'ny hetsika MMLV dia 37-50 ° C, ary AMV dia 42-60 ° C).Ny ARN viriosy sarotra kokoa dia tsy azo adika amin'ny fomba mahomby amin'ny cDNA amin'ny mari-pana ambany, ka miteraka fahombiazana amin'ny fahitana Ny fampihenana.Ny RT-qPCR nentim-paharazana amin'ny ankapobeny dia mitaky ny fandraisan'anjaran'ny anzima fototra roa (reverse transcriptase sy ADN polymerase), izay tsy azo atao ny manatsotra ny fiasan'ny rafitra fanehoan-kevitra ary mampihena ny vidiny.Eto isika dia hampiditra transcriptases mivadika roa mahatohitra hafanana, TtH sy RevTaq.Ireo anzima roa ireo koa dia manana ny asan'ny ADN polymerase, ka antsoina hoe enzyme bifunctional.

TtH ADN polymerase

Tsy maintsy efa nandre momba ny TtH ianao, izay avy amin'ny bakteria thermophilic Thermus thermophilus HB8.Eo anatrehan'ny cation divalent toy ny Mg2+ dia manana hetsika polymerase ADN izy io.Ampiasaina betsaka amin'ny fanehoan-kevitry ny PCR toa an'i Taq enzyme izy io, saingy manana fanoherana hafanana ambony kokoa noho ny anzima Taq, noho izany dia misy fiantraikany tsara kokoa amin'ny PCR miaraka amin'ny maodely votoaty GC avo lenta.

· Ity enzyme ity amin'ny ankapobeny dia tsy manana hetsika exonuclease 3′→5′ sy hetsika exonuclease 5′→3′, noho izany dia azo ampiasaina amin'ny filaharana dideoxy ihany koa.

Ity enzyme ity dia manana asa RTase.Eo anatrehan'ny Mn2+ dia hihatsara ny hetsika RTase.Amin'ny fampiasana an'io endri-javatra io, dia azo ampiasaina izy io mba hanatanterahana ny fihetsiky ny transcription mivadika sy ny fanehoan-kevitry ny PCR ao anaty fantsona iray ihany, izany hoe, dingana iray RT-PCR.Na izany aza, eo anatrehan'ny Mn2 +, ny fahamarinan'ny RT-PCR dia tsy avo.Ny hetsika RT dia tsy misy ifandraisany amin'ny hetsika rnaase H.

· Ny fitomboan'ny asan'ny Tth-DNA polymerase (pH9, optimum +55℃～+70℃, ambony indrindra +95℃) dia mandresy ireo olana ateraky ny rafitra faharoa RNA.Ny cDNA vokarina dia azo ampitomboina amin'ny PCR miaraka amin'ny enzyme mitovy amin'ny fisian'ny ion Mg2+.

· Ny fahafahan'ny Tth-DNA polymerase manao transcription mivadika sy ny fanamafisan'ny ADN amin'ny mari-pana ambony dia mahatonga an'io enzyme io ho ilaina amin'ny famakafakana RT-PCR, cloning, ary fanehoana fototarazo momba ny RNA sela sy viriosy.
· Tth-DNA polymerase dia ampiasaina amin'ny RT-PCR hanamafisana ny ARN hatramin'ny 1kb.

Toetra sy tombony

ADN polymerase:

• Ataovy azo antoka ny haben'ny vokatra polymerase chain reaction (PCR), fara fahakeliny 1000 bp amin'ny valin'ny RT-PCR

• Raiso ny deoxyribonucleoside triphosphate novaina ho substrate

• Tsy mifandray amin'ny hetsika RNase H

• Manana fitoniana mafana avo lenta mba handresena olana, matetika mifandray amin'ny rafitra faharoa avo lenta misy ao amin'ny RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymerase

ADN polymerase mahatohitra hafanana miaraka amin'ny hetsika reverse transcriptase

RevTaq-RT-PCR-DNA polymerase dia anzima vita amin'ny hafanana, mahatohitra hafanana, miasa roa miaraka amin'ny transcriptase mivadika ary hetsika polymerase ADN azo amin'ny alàlan'ny fivoarana mivantana sy artifisialy.

· Ny antsasaky ny fiainan'ny RevTaq RT-PCR DNA polymerase amin'ny 95°C dia mihoatra ny 40 minitra.

· RevTaq RT-PCR ADN polymerase dia ahafahan'ny transcription mifamadika amin'ny hafanana ambony mivantana avy amin'ny môdely RNA, ary azo averina im-betsaka ny dingan'ny fandikana mivadika mba hamoronana môdely cDNA bebe kokoa.

RevTaq RT-PCR DNA polymerase dia mamela ny RT-PCR "tsy misy dingana" (tsy misy dingan'ny transcription isothermal), satria amin'ny dingana fanitarana PCR cyclic dia mitranga miaraka ny fandikana mivadika sy ny fanamafisana ny ADN.Izany koa dia mampiroborobo ny fihetsiky ny transcription mivadika amin'ny mari-pana ambony, ka manamaivana ny olana sedraina amin'ny fanalefahana ny rafitra faharoa matanjaka ao amin'ny RNA amin'ny hafanana avo.

· Noho ny aptamer-based hot-start formula, RevTaq RT-PCR DNA polymerase dia hamokatra vokatra tsara kokoa rehefa mihoatra ny 57°C ny mari-pana fanalana sy fanitarana.

· Koa satria mahatohitra hafanana ilay enzyme, dia soso-kevitra ny hamolavola primers sy probe misy teboka levona avo be (>60°C).

· Amporisihina ny manatsara ny mari-pana amin'ny dingan'ny fanalefahana/fanitarana amin'ny alàlan'ny gradient maripana mandritra ny dingan'ny fametrahana fanehoan-kevitra.

· Arakaraky ny avo ny mari-pana, ny avo kokoa ny specificity ny PCR.Ny tsingerin'ny fandikana mifamadika dia matetika atao amin'ny mari-pana ambony kokoa noho ny tsingerin'ny PCR, satria ny ADN Primer: RNA Template hybridization matetika dia manana teboka levona ambony kokoa noho ny ADN Primer: cDNA Template duplex.

· RevTaq RT-PCR DNA polymerase dia novolavolaina sy nohatsaraina, ary eo anelanelan'ny 60-300 bp ny haben'ny amplicon.

RevTaq RT-PCR ADN polymerase fetran'ny fitiliana mahatratra 4 kopia /

Ny rafitra fanehoan-kevitra optimized (ny fametrahana primers amin'ny teboka avo lenta) dia aseho amin'ny sary.RevTaq RT-PCR ADN polymerase-driven RT-PCR dia mampiseho fahatsapana tsara kokoa noho ny TaqPath 1-dingana RT-qPCR master mix, ary ambany kokoa ny fahitana ny gradient dilution santionany.

Tombontsoa bebe kokoa:

Fampandehanana haingana → Ny dingana denaturation mafana voalohany dia azo tsidihana.

Raikipohy aptamer manomboka mafana → Manomeza hetsika anzima 100% avy hatrany ary misoroka ny fanamafisana tsy voafaritra amin'ny hafanana ambany (<57°C).

Ny fiasan'ny cleavage → Ny dingana fitrandrahana RNA dia avela, satria ny RevTaq RT-PCR DNA polymerase dia afaka manodina santionany fanehoan-kevitra maloto.Afaka manimba avy hatrany ny fonon'ny sela misy eukaryotes, bakteria ary viriosy amin'ny tsingerin'ny RT-PCR mafana.

IVD akora fototra → fenitra avo lenta sy vidiny tena mifaninana