Fitaovana fanombohana: RNA

Quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR) dia fomba andrana ampiasaina amin'ny andrana PCR mampiasa RNA ho fitaovana fanombohana.Amin'ity fomba ity, ny totalin'ny RNA na ny messenger RNA (mRNA) dia nadika voalohany ho ADN mifameno (cDNA) amin'ny alàlan'ny transcriptase mivadika.Avy eo dia nisy fanehoan-kevitra qPCR natao tamin'ny fampiasana ny cDNA ho modely.RT-qPCR dia nampiasaina tamin'ny fampiharana biolojia molekiola isan-karazany, ao anatin'izany ny famakafakana ny fanehoana ny fototarazo, ny fanamarinana ny fitsabahan'ny RNA, ny fanamarinana microarray, ny fitiliana ny pathogen, ny fitiliana fototarazo ary ny fikarohana aretina.

Fomba tokana sy dingana roa ho an'ny RT-qPCR

Ny RT-qPCR dia azo tanterahina amin'ny fomba dingana iray na dingana roa.Ny RT-qPCR dingana iray dia manambatra ny transcription mivadika sy ny fanamafisam-peo PCR, mamela ny transcriptase mivadika sy ny polymerase ADN hamita ny fanehoan-kevitra ao anaty fantsona mitovy amin'ny fepetra mitovy.Ny RT-qPCR dingana iray ihany no mitaky ny fampiasana primers manokana.Amin'ny dingana roa RT-qPCR, ny fandikana mivadika sy ny fanamafisam-peo PCR dia atao amin'ny fantsona roa, amin'ny alàlan'ny buffers samy hafa, ny fepetra fanehoan-kevitra, ary ny paikady famolavolana primer.

lahatsoratra1

 

tombony

tombon-dahiny

Dingana iray Ity fomba ity dia tsy dia misy hadisoana amin'ny fanandramana satria ny fanehoan-kevitra roa dia atao ao anaty fantsona iray

 

Vitsy kokoa ny dingana fanaovana pipetting dia mampihena ny mety hisian'ny loto

 

Mety amin'ny amplification / screening avo lenta, haingana ary azo averina

Ny fanehoan-kevitra amin'ny dingana roa dia tsy azo amboarina manokana

 

Koa satria ny fepetra fanehoan-kevitra dia mampandefitra amin'ny fampifangaroana ny fanehoan-kevitra dingana roa, ny fahatsapana dia tsy tsara toy ny an'ny fomba dingana roa.

 

Kely ny isan'ny lasibatra hitan'ny santionany iray

Dingana roa Fahaizana mamorona tranomboky cDNA stable izay azo tehirizina mandritra ny fotoana maharitra ary ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra marobe

 

Ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo reference dia azo ampitomboina avy amin'ny tranomboky cDNA mitovy nefa tsy mila tranomboky cDNA marobe.

 

Reaction buffers sy toe-javatra fanehoan-kevitra izay ahafahana manatsara ny hetsika tokana

 

Fifidianana mora azo amin'ny fepetra trigger

Ny fampiasana fantsona maromaro, ary ny dingana fitetezana bebe kokoa dia mampitombo ny mety hisian'ny fandotoana ADN,

ary mandany fotoana.

 

Mitaky fanatsarana bebe kokoa noho ny fomba iray dingana

Vokatra mifandraika:

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Iray dingana)-SYBR Green I

RT-qPCR Easyᵀᴹ (dingana iray)-Taqman

RT Easyᵀᴹ I Master Premix ho an'ny Synthesis CDNA First-Strand

PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit amin'ny fotoana tena izy

Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman

Fifidianana ny totalin'ny RNA sy ny mRNA

Rehefa mamolavola fanandramana RT-qPCR dia zava-dehibe ny manapa-kevitra raha hampiasa ny totalin'ny RNA na ny mRNA voadio ho modely amin'ny fandikana mivadika.Na dia mety afaka manome fahatsapana kely kokoa aza ny mRNA, dia mbola ampiasaina matetika ny totalin'ny RNA.Ny anton'izany dia ny totalin'ny RNA dia manana tombony lehibe kokoa ho fitaovana fanombohana noho ny mRNA.Voalohany, ny dingana dia mitaky dingana fanadiovana vitsy kokoa, izay miantoka ny famerenana amin'ny laoniny ny môdely sy ny normalization tsara kokoa ny vokatra manomboka amin'ny isa sela.Faharoa, misoroka ny dingana fampitomboana mRNA izy io, izay afaka misoroka ny mety hisian'ny valiny mitongilana noho ny famerenana ny mRNA samihafa.Amin'ny ankapobeny, satria amin'ny ankamaroan'ny fampiharana dia zava-dehibe kokoa noho ny fahatsapan-tena tanteraka ny RNA manontolo amin'ny ankamaroan'ny tranga.

Mivadika ny transcription primer

Ao amin'ny fomba dingana roa, fomba telo samihafa no azo ampiasaina hanesorana ny fanehoan-kevitry ny cDNA: primers oligo(dT), primers kisendrasendra, na primers spécific sequence.Amin'ny ankapobeny, ny primer oligo(dT) sy ny primer kisendrasendra dia ampiasaina miaraka.Ireo primer ireo dia mipetaka amin'ny tadin'ny mRNA mRNA ary manome transcriptase mivadika miaraka amin'ny teboka fanombohana ho an'ny synthesis.

lahatsoratra2

Fantenana voalohany Ny rafitra sy ny asany tombony tombon-dahiny
Oligo(dT) primer (na vatofantsika oligo(dT) primer) Fametahana lava amin'ny sisa tavela amin'ny thymine amin'ny rambony poly(A) amin'ny mRNA;Ny primer oligo (dT) vatofantsika dia misy G, C, na A amin'ny faran'ny 3′ (toerana vatofantsika) Synthesis ny cDNA feno lava avy amin'ny poly(A)-tailed mRNA

 

Azo ampiharina rehefa misy fitaovana fanombohana kely kokoa

 

Ny toerana fatorana dia miantoka fa ny primer oligo(dT) dia mifatotra amin'ny rambony 5′ poly(A) amin'ny mRNA

Mety amin'ny fanamafisana ny fototarazo misy rambo poly(A).

 

Mahazoa cDNA tapaka avy amin'ny toerana voalohany * 2 amin'ny poly(A)

 

Mitongilana mamatotra amin'ny faran'ny 3′*

 

*Mihena io fahafaha-manao io raha ampiasaina ny primer oligo(dT).

kisendrasendra primer

 

6 ka hatramin'ny 9 fototra ny halavany, izay afaka miraikitra amin'ny toerana maro mandritra ny transcription RNA Fanafody amin'ny RNA rehetra (tRNA, rRNA, ary mRNA)

 

Mety amin'ny fandikana misy rafitra faharoa manan-danja, na rehefa misy fitaovana fanombohana kely kokoa

 

Mamokatra cDNA avo

Ny cDNA dia nadika mivadika avy amin'ny RNA rehetra, izay matetika tsy tiana ary mety manimba ny famantarana ny mRNA kendrena.

 

tapaka ny cDNA

primers manokana sequence Primer manokana mikendry ny filaharana mRNA manokana tranomboky cDNA manokana

 

Manatsara ny fahatsapana

 

Mampiasa primer qPCR mivadika

Voafetra ihany amin'ny synthesis ny fototarazo kendrena tokana

Reverse transcriptase

Reverse transcriptase dia anzima izay mampiasa ARN mba hamoronana ADN.Ny transcriptase mivadika sasany dia manana hetsika RNase ary afaka manimba ny tady RNA ao amin'ny tady hybrid RNA-DNA aorian'ny fandikana.Raha tsy manana hetsika enzymatic RNase izy, dia azo ampiana RNaseH ho an'ny fahombiazan'ny qPCR ambony kokoa.Ny anzima fampiasa matetika dia ny virus Moloney murine leukemia reverse transcriptase sy ny viriosy myeloblastoma avian reverse transcriptase.Ho an'ny RT-qPCR, tsara ny misafidy transcriptase mivadika amin'ny thermostability ambony kokoa, mba hahafahan'ny cDNA synthesis azo atao amin'ny mari-pana ambony kokoa, hiantohana ny fandikana mahomby amin'ny RNA miaraka amin'ny rafitra faharoa ambony, ary mitazona ny asany feno mandritra ny fanehoan-kevitra, ka miteraka avo kokoa. cDNA vokatra.

Vokatra mifandraika:

Foreasy M-MLV Reverse Transcriptase

RNase H hetsika amin'ny transcriptase mivadika

Ny RNaseH dia afaka manimba ny tadin'ny RNA avy amin'ny duplexes RNA-DNA, ahafahan'ny synthesis mahomby amin'ny ADN misy tady roa.Na izany aza, rehefa mampiasa mRNA lava ho môdely, ny RNA dia mety ho simba aloha loatra, ka miteraka cDNA tapaka.Noho izany, matetika dia mahasoa ny manamaivana ny asan'ny RNaseH mandritra ny cloning cDNA raha tiana ny synthesis transcripts lava.Mifanohitra amin'izany kosa, ny transcriptase mivadika amin'ny hetsika RNase H dia matetika mahasoa amin'ny fampiharana qPCR satria manatsara ny fandoroana ny duplexes RNA-DNA mandritra ny tsingerin'ny PCR voalohany.

Famolavolana voalohany

Ny primer PCR ampiasaina amin'ny dingana qPCR ao amin'ny RT-qPCR dia tokony hamboarina tsara amin'ny fihaonan'ny exon-exon, izay mety hamakivaky ny sisintany exon-intron ny primer amplification.Koa satria tsy ampitomboina ny filaharan'ny ADN genomika misy intron, dia mampihena ny mety hisian'ny vokatsoa diso ampitomboina amin'ny fandotoana ny ADN genomika ity famolavolana ity.

Raha tsy azo atao ny manasaraka ny sisin-tany exon na exon-exon ny primers, dia mety ilaina ny mitsabo ny santionany RNA miaraka amin'ny DNase I na dsDNase tsy misy RNase mba hanesorana ny fandotoana ADN.

Fanaraha-maso RT-qPCR

Ny fanaraha-maso ratsy (-RT control) dia tokony hampidirina amin'ny fanandramana RT-qPCR rehetra hamantarana ny fandotoana ADN (toy ny DNA génomika na vokatra PCR avy amin'ny fanehoan-kevitra teo aloha).Ity fanaraha-maso ity dia ahitana singa fanehoan-kevitra rehetra afa-tsy ny reverse transcriptase.Koa satria tsy mitranga amin'ity fanaraha-maso ity ny fandikana mivadika, raha tsikaritra ny fanamafisana ny PCR, dia azo inoana fa ny fandotoana avy amin'ny ADN.


Fotoana fandefasana: Aug-02-2022