Amin'ny andrana qPCR, rohy tena ilaina ihany koa ny famolavolana primer.Na mety na tsia ny primer dia mifandray akaiky amin'ny hoe tonga amin'ny fenitra ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo, na voafaritra manokana ny vokatra ampitomboina, ary raha misy ny vokatra andrana.
Ka ahoana ny fomba hanatsarana ny spécialité primer qPCR?Fahombiazan'ny amplification avo lenta?
Androany, hitondra anao izahay hamolavola ireo primer qPCR, ary avelao ho lasa fahaiza-manao mahomby amin'ny andrana ny famolavolana primer qPCR.
Rehefa mamolavola primer qPCR, dia tandremo matetika ireto teboka manaraka ireto: ny primer dia tokony hamboarina manerana ny intron araka izay azo atao, ny halavan'ny vokatra dia tokony ho 100-300 bp, ny sanda Tm dia tokony ho akaiky araka izay azo atao amin'ny 60 ° C, ary ny primers ambony sy ambany dia tokony ho akaiky araka izay azo atao, ary ny faran'ny primer dia tokony ho G na C, sns.
1. Famolavolana primers manelanelana ny intron
Rehefa mamolavola ny primer qPCR, ny fisafidianana ny primer natao manerana ny intron dia afaka manakana ny môdely gDNA tsy hihamatanjaka, ary ny vokatra dia avy amin'ny fanamafisana ny cDNA, ka manafoana ny fiantraikan'ny fandotoana gDNA.
2. Lava voalohany
Ny halavan'ny primer dia matetika eo anelanelan'ny 18-30 nt, ary ny halavan'ny vokatra fanamafisam-peo dia tokony hofehezina eo anelanelan'ny 100-300 bp araka izay azo atao.
Raha fohy loatra ny primer dia hitarika amin'ny fanamafisam-peo tsy voafaritra, ary raha lava loatra, dia ho mora ny mamorona rafitra faharoa (toy ny firafitry ny hairpin).Raha lava loatra ny vokatra fanamafisam-peo, dia tsy mety amin'ny fihetsiky ny polymerase izany, izay hisy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny amplification PCR.
3. Ny votoatin'ny GC sy ny sandan'ny Tm
Ny votoatin'ny GC amin'ny primer dia tokony hofehezina eo anelanelan'ny 40% sy 60%.Raha avo loatra na ambany loatra izany, dia tsy mety amin'ny fanombohana ny fanehoan-kevitra.Ny votoatin'ny GC amin'ny primers mandroso sy miverina dia tokony hitovy mba hahazoana ny sanda Tm mitovy sy ny mari-pana.
Ny sandan'ny Tm dia tokony ho eo anelanelan'ny 55-65°C araka izay azo atao, amin'ny ankapobeny manodidina ny 60°C, ary ny sandan'ny Tm amin'ny ambony sy ambany dia tokony ho akaiky araka izay azo atao, raha tsy mihoatra ny 4°C.
4. Aza mifidy A amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer
Rehefa tsy mifanentana ny fiafaran'ny 3′ amin'ny primer, dia misy fahasamihafana lehibe eo amin'ny fahombiazan'ny synthesis amin'ny fototra samihafa.Rehefa A ny fototra farany dia afaka manomboka synthesis rojo ihany koa izy na dia amin'ny tranga tsy mifanaraka aza, ary rehefa T ny fototra farany, dia mihena be ny fahombiazan'ny induction tsy mifanentana.Noho izany, miezaha tsy mifidy A amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer, ary tsara kokoa ny misafidy T.
Raha primer probe ilay izy, dia tsy mety ho G ny faran'ny 5′ amin'ny probe, satria na dia mifandray amin'ny vondrona mpanao gazety fluorescent FAM aza ny fototra G tokana, dia afaka mamono ihany koa ny famantarana fluorescent navoakan'ny vondrona FAM ny G, ka miteraka vokatra ratsy diso.Miseho.
5. Fizarana fototra
Ny fizarana ny fototra efatra ao amin'ny primer dia tsara kokoa noho ny kisendrasendra, misoroka mihoatra ny 3 G na C mifanesy amin'ny 3′ farany, ary mihoatra ny 3 misesy.G na C dia mora ny mamorona fampiarahana ao amin'ny faritra manankarena GC.
6. Ny faritra famolavolana primer dia tokony hialana amin'ny rafitra faharoa sarotra.
Ny rafitra faharoa namboarin'ny tady tokana amin'ny vokatra fanamafisam-peo dia hisy fiantraikany amin'ny fivoaran'ny PCR.Amin'ny faminaniany raha misy rafitra faharoa ao amin'ny filaharana kendrena mialoha, andramo ny misoroka io faritra io amin'ny famolavolana primers.
7. Ny primers mihitsy sy eo anelanelan'ny primers dia tokony hiezaka ny hisoroka ny fototra mifameno mifanesy.
Tsy azo atao ny mifameno fototra 4 misesy eo amin'ny primer sy ny primer.Ny primer mihitsy dia tsy tokony hanana filaharana mifameno, raha tsy izany dia hiforitra izy mba hamorona firafitry ny volo, izay hisy fiantraikany amin'ny fitambaran'ny annealing ny primer sy ny môdely.
Tsy misy filaharana mifameno eo anelanelan'ny primer ambony sy ambany.Ny famenoana eo amin'ny primer dia hamokatra dimer primer, izay hampihena ny fahombiazan'ny PCR ary hisy fiantraikany amin'ny fahamarinan'ny quantitative mihitsy aza.Raha tsy azo ihodivirana ny firafitry ny primer-dimer sy ny hairpin, dia tsy tokony ho avo loatra ny sanda △G (tokony ho latsaky ny 4,5 kcal/mol).
8. Ny primers dia mampitombo ny vokatra kendrena manokana.
Ny tanjona faratampony amin'ny fitadiavana qPCR dia ny hahatakatra ny habetsahan'ny fototarazo kendrena.Raha misy fanamafisam-peo tsy voafaritra dia tsy marina ny famaritana.Noho izany, aorian'ny famolavolana ny primers dia mila andrana amin'ny BLAST izy ireo, ary ampitahaina amin'ny angon-drakitra filaharana ny maha-tokana ny vokatra.
Manaraka, maka ny GAS6 olombelona (Growth fisamborana manokana 6) ho ohatra amin'ny famolavolana primer qPCR.
01 fanontaniana gen
Homo GAS6amin'ny alàlan'ny NCBI.Eto isika dia tokony handinika tsara ny fampitahana ny anaran'ny fototarazo sy ny karazana mba hahazoana antoka fa mifanaraka izy ireo.
02 Tadiavo ny filaharan'ny fototarazo
(1) Raha ADN génomika ny filaharana kendrena, safidio ny voalohany, dia ny filaharan'ny ADN génomika an'ilay fototarazo.
(2) Raha mRNA ny filaharana kendrena, safidio ny faharoa.Aorian'ny fidirana dia tsindrio ny "CDS" eo amin'ny tabilao etsy ambany.Ny filaharan'ny background volontsôkôlà dia ny filaharan'ny fototarazo.
03 Design primers
Ampidiro ny interface Primer-BLAST
Ampidiro ny laharan'ny filaharan'ny fototarazo na ny filaharana amin'ny endrika Fasta eo amin'ny ankavia ambony, ary fenoy ireo masontsivana mifandraika amin'izany.

Kitiho ny "Get primers" ary hipoitra ny NCBI hilaza aminao fa ny fifantenana paramètre toy izany dia hohamafisina amin'ny variana splicing hafa.Azontsika atao ny manamarina ireo variana splicing samihafa ary manolotra azy ireo mba hahazoana ny mpivady voalohany (araka ny aseho amin'ny sary etsy ambany).Ity dingana ity dia mety haharitra folo segondra vao mandeha.
Manodidina ny 60°C avokoa ny hafanan’ireo mpivady voalohany.Araka ny tanjon'ny fanandramana, mifidiana primers amin'ny antonony ny halavany, tsara specificity ary tsy ampy famenon'ny tena ny primers ho an'ny fanandramana, ary ny taham-pahombiazana dia tena avo!
04 Fanamarinana manokana voalohany
Raha ny marina, ankoatry ny fandrafetana ny primer, ny Primer-Blast dia afaka manombana ihany koa ny primer izay novolavolainay.Miverena any amin'ny pejy fandrafetana voalohany, midira ao amin'ny ambaratonga ambony sy ambany izay novolavolainay, ary tsy ahitsy ny mari-pamantarana hafa.Aorian'ny fanolorana dia azonao jerena raha misy koa ny fototarazo roa amin'ny fototarazo hafa.Raha aseho amin'ny fototarazo tiantsika hohamafisina daholo izy ireo, dia manondro fa tsara ny mampiavaka an'ity mpivady voalohany ity!(Ohatra, ity no hany vokatry ny fangatahana voalohany!)

05 Fitsarana kalitao voalohany
Inona no karazana primer "tonga lafatra" izay manambatra ny "fahavitrihana amin'ny fanamafisam-peo mifanaraka amin'ny fenitra", "ny toetran'ny vokatra ampitomboina", ary ny "vokatra andrana azo itokisana"?
Fahombiazan'ny amplification

curve mitsonika
Ny fahombiazan'ny fanamafisana ny primers dia mahatratra 90% -110%, izay midika fa ny fahombiazan'ny amplification dia tsara, ary ny curve miempo dia manana tampony tokana ary matetika Tm> 80 ° C, izay midika fa tsara ny fanamafisana manokana.
 
Vokatra mifandraika:
Real Time PCR Easy–SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman