Ny PCR (polymerase chain reaction) dia iray amin'ireo teknolojia fanamafisana ny ADN in-vitro, izay manana tantara mihoatra ny 30 taona.

Ny teknolojia PCR dia notarihin'i Kary Mullis avy any Cetus, Etazonia tamin'ny 1983. Nangataka patanty PCR i Mullis tamin'ny 1985 ary namoaka ny taratasy akademika PCR voalohany momba ny Siansa tamin'io taona io ihany.Mullis dia nahazo ny loka Nobel momba ny simia tamin'ny 1993 noho ny asany.

Fitsipika fototra amin'ny PCR

Ny PCR dia afaka mampitombo ny sombintsombin'ny ADN kendrena mihoatra ny iray tapitrisa.Ny fitsipika dia eo ambanin'ny catalysis ny ADN polymerase, amin'ny fampiasana ny tadin'ny ray aman-dreny ho modely ary ny primer manokana ho toerana fanombohana ny fanitarana.Averina in vitro amin'ny alalan'ny dingana toy ny denaturation, annealing ary fanitarana.Ny dingan'ny ADN strand zanaka vavy mifameno amin'ny ADN modelin'ny ray aman-dreny.

Ny dingana PCR mahazatra dia mizara ho dingana telo:

1.Denaturation: Mampiasà mari-pana ambony hanasarahana ny tady roa ADN.Tapaka amin'ny hafanana ambony (93-98 ℃) ny fatoran'ny hidrôzenina eo amin'ny tady roa ADN.

2. Annealing: Aorian'ny fisarahana ny ADN misy tady roa, ampidino ny mari-pana mba hahafahan'ny primer mifatotra amin'ny ADN tokana.

3. Fanitarana: Ny polymerase ADN dia manomboka manambatra tady mifameno amin'ny tady ADN avy amin'ny primer voafatotra rehefa midina ny mari-pana.Rehefa vita ny fanitarana, dia vita ny tsingerina iray, ary mitombo avo roa heny ny isan'ny sombintsombin'ny ADN

Ny famerenana ireo dingana telo ireo in-25-35, dia hitombo be ny isan'ny sombintsombin'ny ADN.

Ny fahaiza-manaon'ny PCR dia ny hoe ny primer samihafa dia azo natao ho an'ny fototarazo kendrena samihafa, mba hahafahan'ireo sombin-taranaka kendrena ho azo ampitomboina ao anatin'ny fotoana fohy.

Hatreto dia azo zaraina ho sokajy telo ny PCR, dia ny PCR tsotra, ny PCR quantitative fluorescent ary ny PCR nomerika.

Ny taranaka voalohany amin'ny PCR mahazatra

Mampiasà fitaovana fanamafisam-peo PCR mahazatra mba hanamafisana ny fototarazo kendrena, ary avy eo ampiasao ny electrophoresis gel agarose hamantarana ny vokatra, ny fanadihadiana kalitao ihany no azo atao.

Ny tena fatiantoka ny taranaka voalohany PCR:

1. Mora amin'ny fanamafisana tsy voafaritra sy valiny tsara diso.

2. Mitaky fotoana lava ny fitadiavana ary sarotra ny fandidiana.

3. Ny fitsapana kalitao ihany no azo atao

PCR Real-Time taranaka faharoa

Ny PCR Real-Time, fantatra ihany koa amin'ny hoe qPCR, dia mampiasa probe fluorescent izay afaka manondro ny fandrosoan'ny rafitra fanehoan-kevitra, ary manara-maso ny fanangonana ny vokatra ampitomboina amin'ny alàlan'ny fanangonan-tsonia fluorescent, ary mitsara ny valiny amin'ny alàlan'ny curve fluorescence.Azo isaina amin'ny fanampian'ny sanda Cq sy ny curve mahazatra.

Satria ny teknolojia qPCR dia tanterahana amin'ny rafitra mihidy, mihena ny mety hisian'ny fandotoana, ary ny mari-pamantarana fluorescence dia azo araha-maso amin'ny fitiliana quantitative, ka izany no be mpampiasa indrindra amin'ny fampiharana klinika ary lasa teknolojia lehibe indrindra amin'ny PCR.

Ny akora fluorescent ampiasaina amin'ny PCR fatran'ny fluorescent tena izy dia azo zaraina amin'ny: TaqMan fluorescent probe, molecular beacons ary fluorescent dye.

1) TaqMan fluorescent probe:

Mandritra ny fanamafisam-peo PCR, misy probe fluorescent manokana ampiana rehefa manampy primer roa.Ny probe dia oligonucleotide, ary ny tendrony roa dia misy marika miaraka amin'ny vondrona fluorescent mpanao gazety sy vondrona fluorescent quencher.

Rehefa tsy misy dikany ny probe, ny famantarana fluorescent avoakan'ny vondrona mpanao gazety dia lasan'ny vondrona famonoana;mandritra ny fanamafisam-peo PCR, ny hetsika exonuclease 5′-3′ an'ny Taq enzyme dia manapaka sy manimba ny probe, ka mahatonga ny mpanao gazety fluorescent group sy quencher. Ny vokatra PCR.

2) SYBR fluorescent loko:

Ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitry ny PCR dia ampiana ny lokon'ny fluorescent SYBR.Taorian'ny fandokoana fluorescent SYBR dia tsy nampidirina manokana ao amin'ny tady roa ADN, dia mamoaka famantarana fluorescent izy.Ny molekiolan'ny lokon'ny SYBR izay tsy tafiditra ao anatin'ny rojo dia tsy hamoaka famantarana fluorescent, ka hiantoka ny famantarana ny fluorescent Ny fitomboan'ny vokatra PCR dia mifanaraka tanteraka amin'ny fitomboan'ny vokatra PCR.Ny SYBR dia mifamatotra amin'ny ADN mitongilana roa ihany, noho izany dia azo ampiasaina hamaritana raha voafaritra ny fihetsiky ny PCR.

3) Fanilo molekiola:

Izy io dia probe oligonucleotide misy marika roa misy marika roa izay mamorona firafitry ny volo misy fototra 8 eo amin'ny tendrony 5 sy 3.Ny filaharan'ny asidra nokleika amin'ny tendrony roa dia mifameno, ka mahatonga ny vondrona fluorescent sy ny vondrona famonoana ho henjana.Akatona, tsy hisy fluorescence havoaka.

Aorian'ny famoahana ny vokatra PCR, mandritra ny dingan'ny fanodinana, ny tapany afovoan'ny molekiola dia ampiarahina amin'ny filaharan'ny ADN manokana, ary ny fototarazo fluorescent dia misaraka amin'ny fototarazo famonoana mba hamokarana fluorescence.

Ny tsy fahampiana lehibe amin'ny PCR andiany faharoa:

Mbola tsy ampy ny fahatsapana, ary tsy marina ny fahitana ireo santionany ambany.

Misy ny fitaoman'ny sandan'ny afara, ary ny vokatra dia mety ho tratran'ny fitsabahana.

Rehefa misy ny PCR inhibitors ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra, ny valin'ny fitiliana dia mety ho tratry ny fitsabahana.

PCR nomerika taranaka fahatelo

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) dia manao kajy ny laharan'ny dika mitovy amin'ny filaharana kendrena amin'ny alàlan'ny fitsirihana ny teboka farany, ary afaka manao fitsirihana fatra tanteraka tsy misy fanaraha-maso anatiny sy curve mahazatra.

Ny PCR nomerika dia mampiasa ny fitsirihana ny teboka farany ary tsy miankina amin'ny sandan'ny Ct (tsingerin'ny tsingerina), noho izany dia tsy dia misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny fanamafisana ny PCR nomerika, ary mihatsara ny fandeferana amin'ny inhibitors fanehoan-kevitra PCR, miaraka amin'ny fahitsiana sy ny famerenana indray.

Noho ny toetran'ny fahatsapan-tena ambony sy ny fahitsiana avo lenta, dia tsy mora manelingelina amin'ny alàlan'ny PCR fanehoan-kevitra inhibitors, ary afaka hahatratra ny tena quantification tanteraka tsy misy fenitra vokatra, izay lasa fikarohana sy ny fampiharana hotspot.

Araka ny endrika isan-karazany ny vondrona fanehoan-kevitra, dia azo zaraina ho telo lehibe: microfluidic, chip sy droplet rafitra.

1) Microfluidic digital PCR, mdPCR:

Miorina amin'ny teknolojia mikrofluida, misaraka ny môdely ADN.Ny teknolojia microfluidic dia afaka mahatsapa ny santionany nano-fanavaozana na ny famokarana tsimoka kely kokoa, fa ny vongan-drano dia mila fomba adsorption manokana ary avy eo mitambatra amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR.Ny mdPCR dia noraisina tsikelikely tamin'ny fomba hafa fanoloana.

2) PCR nomerika mifototra amin'ny droplet, ddPCR:

Mampiasà teknolojia famokarana ranon-tsolika amin'ny alàlan'ny fanodinana ny santionany ho vongan-drano, ary zarao ny rafitra fanehoan-kevitra misy molekiola nokleika amin'ny molekiola nanoscale an'arivony, ny tsirairay amin'izy ireo dia tsy misy ny molekiolan'ny asidra nokleary ho hita, na misy molekiolan'ny asidra nokleika maromaro hotsapaina.

3) PCR nomerika mifototra amin'ny chip, cdPCR:

Ampiasao ny teknolojian'ny làlan-drivotra mitambatra mba hanoratana microtubes sy microcavities maro amin'ny wafers silisiôma na vera quartz, ary hifehy ny fikorianan'ny vahaolana amin'ny alàlan'ny valva fanaraha-maso samihafa, ary zarao ny ranon-tsavony amin'ny nanometers mitovy habe amin'ny fantsakana fanehoan-kevitra ho an'ny PCR Reaction nomerika mba hahatratrarana ny fandrefesana tanteraka.

Ny tena fatiantoka ny taranaka fahatelo PCR:

Ny fitaovana sy ny reagents dia lafo.

Ny fepetra takian'ny kalitao modely dia avo.Raha mihoatra ny habetsahan'ny microsystem ny habetsan'ny môdely, dia tsy ho azo atao ny hamantatra, ary raha kely loatra izany dia hihena ny fahamarinan'ny famakafakana.

Ny fanenjehana diso koa dia mety hipoitra rehefa misy fanamafisam-peo tsy voafaritra.