一, Ampitomboy ny fahatsapana ny rafitra fanehoan-kevitra:

1. Atokana ny ARN avo lenta:

Ny synthesis cDNA mahomby dia avy amin'ny ARN avo lenta.Ny ARN avo lenta dia tokony ho lava lava ary tsy misy inhibitors transcriptase mivadika toy ny EDTA na SDS.Ny kalitaon'ny RNA dia mamaritra ny habetsaky ny fampahalalana momba ny filaharana azonao adika amin'ny cDNA.Ny fomba fanadiovana RNA mahazatra dia fomba iray dingana amin'ny fampiasana guanidine isothiocyanate / asidra phenol.Mba hisorohana ny fandotoana amin'ny alàlan'ny fatran'ny RNase, ny RNA mitokana amin'ny santionany manankarena RNase (toy ny pancreas) dia mila tehirizina ao anaty formaldehyde mba hitehirizana RNA avo lenta, indrindra ho an'ny fitehirizana maharitra.Ny ARN nalaina tamin'ny atin'ny voalavo dia simba tamin'ny ankapobeny rehefa notehirizina tao anaty rano nandritra ny herinandro, fa ny ARN nalaina tamin'ny voalavo dia nitoetra ho mafy orina rehefa notehirizina tao anaty rano nandritra ny 3 taona.Fanampin'izany, ny fandikana lava kokoa noho ny 4 kb dia saro-pady kokoa amin'ny fahasimbana amin'ny alàlan'ny trace RNases noho ny transcript kely.Mba hampitomboana ny fahamarinan'ny santionany RNA voatahiry, ny ARN dia azo levona ao anaty formamide deionized ary tehirizina amin'ny -70 ° C.Ny Formamide ampiasaina amin'ny fitehirizana ny ARN dia tsy maintsy tsy misy fako manimba RNA.Ny ARN avy amin'ny pancreas dia azo tehirizina ao anaty formamide mandritra ny herintaona farafahakeliny.Rehefa miomana amin'ny fampiasana ARN ianao dia azonao atao ny mampiasa ity fomba manaraka ity hanesorana ny ARN: ampio NaCl amin'ny 0,2M ary in-4 ny habetsaky ny ethanol, apetraho amin'ny mari-pana mandritra ny 3-5 minitra, ary centrifuge amin'ny 10,000 × g mandritra ny 5 minitra.

2. Ampiasao ny RNaseH-inactive (RNaseH-) reverse transcriptase:

Ny inhibitors RNase dia matetika ampiana amin'ny fanehoan-kevitry ny transcription mba hampitombo ny halavany sy ny vokatra amin'ny synthesis cDNA.Ny inhibitors RNase dia tokony ampiana mandritra ny fanehoan-kevitry ny synthesis voalohany amin'ny fisian'ny buffer sy ny mpanangom-bokatra (toy ny DTT), satria ny dingana alohan'ny synthesis cDNA dia manafoana ny inhibitor, ka mamoaka RNase mifatotra izay mety hanimba ny ARN.Ny inhibitors proteinina RNase dia manakana ny fanimbana ny RNA amin'ny RNase A, B, C, ary tsy manakana ny RNase amin'ny hoditra, koa mitandrema mba tsy hampiditra RNase avy amin'ny rantsan-tànanao na dia eo aza ny fampiasana ireo inhibitors ireo.

Ny reverse transcriptase dia mampiakatra ny fiovan'ny RNA ho cDNA.Samy manana hetsika RNaseH endogenous ny M-MLV sy AMV ankoatry ny hetsika polymerase azy manokana.Ny hetsika RNaseH sy ny hetsika polymerase dia mifaninana amin'ny tady hybride miforona eo anelanelan'ny môdely RNA sy ny tady fanitarana ny ADN na cDNA, ary manimba ny tady RNA ao amin'ny complex RNA: ADN.Ny môdelin'ny RNA nopotehin'ny hetsika RNaseH dia tsy afaka miasa ho toy ny substrate mahomby ho an'ny synthesis cDNA, izay mampihena ny vokatra sy ny halavan'ny synthesis cDNA.Noho izany dia mety hahasoa ny manafoana na mampihena be ny asan'ny RNaseH amin'ny transcriptase mivadika.

SuperScript Ⅱ reverse transcriptase, RNaseH- MMLV reverse transcriptase ary thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, dia afaka mahazo cDNA bebe kokoa sy lava kokoa noho ny MMLV sy AMV.Ny fahatsapan'ny RT-PCR dia hisy fiantraikany amin'ny habetsahan'ny synthesis cDNA.ThermoScript dia saro-pady kokoa noho ny AMV.Ny haben'ny vokatra RT-PCR dia voafetra amin'ny fahafahan'ny transcriptase mivadika mamolavola cDNA, indrindra rehefa manao cloning cDNA lehibe kokoa.Raha ampitahaina amin'ny MMLV, SuperScripⅡ dia nampitombo be ny vokatra vokatra RT-PCR lava.Ny RNaseH-reverse transcriptase koa dia nampitombo ny thermostability, noho izany dia azo atao amin'ny hafanana ambony noho ny 37-42 ° C ny fanehoan-kevitra.Eo ambanin'ny fepetra synthesis soso-kevitra, ampiasao oligo(dT) primer sy 10 μCi an'ny [α-P]dCTP.Ny totalin'ny vokatra voalohany dia nokajiana tamin'ny alalan'ny TCA.Ny cDNA feno lava dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny tarika voafantina habe ary voaisa amin'ny gel agarose alkaline.

3. Atsangano ny mari-pana incubation ho an'ny transcription mivadika:

Ny hafanan'ny incubation ambony dia manampy amin'ny fanokafana ny rafitra faharoa RNA, mampitombo ny vokatry ny fanehoan-kevitra.Ho an'ny ankamaroan'ny modely RNA, ny fampidirana ny RNA sy ny primers amin'ny 65 ° C tsy misy buffer na sira, arahin'ny fampangatsiahana haingana amin'ny ranomandry dia hanafoana ny ankamaroan'ny rafitra faharoa ary hamela ny primer hifatotra.Na izany aza, ny modely sasany dia mbola manana rafitra faharoa, na dia aorian'ny denaturation hafanana aza.Ny fampitomboana ireo maodely sarotra ireo dia azo atao amin'ny alàlan'ny ThermoScript Reverse Transcriptase ary mametraka ny fanehoan-kevitry ny transcription mivadika amin'ny mari-pana ambony kokoa mba hanatsarana ny fanamafisana.Ny hafanan'ny incubation avo kokoa dia mety hampitombo ny mari-pahaizana manokana, indrindra rehefa ampiasaina amin'ny famokarana cDNA ny fototarazo manokana (GSP) (jereo ny Toko 3).Raha mampiasa GSP, dia ataovy izay hahazoana antoka fa ny Tm-n'ny primer dia mitovy amin'ny mari-pana andrasana amin'ny incubation.Aza mampiasa oligo(dT) sy primer kisendrasendra mihoatra ny 60°C.Ny primer kisendrasendra dia mila incubation amin'ny 25 ° C mandritra ny 10 minitra alohan'ny hampitomboana ny 60 ° C.Ho fanampin'ny fampiasana mari-pana transcription avo kokoa, dia azo hatsaraina ihany koa ny specificity amin'ny alàlan'ny famindrana mivantana ny fangaro RNA/primer avy amin'ny mari-pana denaturation 65 ° C mankany amin'ny mari-pana incubation transcription mivadika ary manampy fifangaroan-dresaka 2 × efa mafana (cDNA hot-start synthesis) .Ity fomba fiasa ity dia manampy amin'ny fisorohana ny fifamatorana fototra intermolecular izay mitranga amin'ny hafanana ambany kokoa.Ny fiovan'ny mari-pana isan-karazany ilaina amin'ny RT-PCR dia azo tsotsotra amin'ny fampiasana cycler mafana.

Tth polymerase thermostable dia miasa toy ny ADN polymerase eo anatrehan'ny Mg2+ ary toy ny RNA polymerase eo anatrehan'ny Mn2+.Azo atao mafana amin'ny hafanana ambony indrindra 65°C.Na izany aza, ny fisian'ny Mn2 + mandritra ny PCR dia mampihena ny fahatokiana, izay mahatonga ny Tth polymerase ho tsy dia mety loatra amin'ny fanamafisana avo lenta, toy ny kloning ny cDNA.Ankoatr'izay, ny Tth dia manana fahombiazan'ny transcription ambany, izay mampihena ny fahatsapana, ary, satria azo atao amin'ny enzyme tokana ny transcription mivadika sy ny PCR, dia tsy azo ampiasaina ny fanehoan-kevitra mifehy tsy misy transcription mivadika mba hampitahana ny vokatra fanamafisam-peo cDNA miaraka amin'ny ADN genomika mandoto.Nisaraka ny vokatra fanamafisam-peo.

4. Fanampiny izay mampiroborobo ny fandikana mivadika:

Ny additives ao anatin'izany ny glycerol sy ny DMSO dia ampiana amin'ny fanehoan-kevitry ny synthesis voalohany, izay mety hampihena ny fahamarinan'ny tadin'ny asidra nucleic double-strand ary mamaha ny rafitra faharoa an'ny ARN.Hatramin'ny 20% glycerol na 10% DMSO dia azo ampiana nefa tsy misy fiantraikany amin'ny hetsika SuperScript II na MMLV.AMV ihany koa dia afaka mandefitra hatramin'ny 20% glycerol tsy misy very asa.Mba hanamafisana ny fahatsapan'ny RT-PCR ao amin'ny SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol dia azo ampiana sy incubated amin'ny 45 ° C.Raha ampiana amin'ny PCR ny 1/10 amin'ny vokatra fanehoan-kevitry ny transcription, dia 0,4% ny fifantohana amin'ny glycerol amin'ny fanehoan-kevitry ny amplification, izay tsy ampy hanakanana ny PCR.

5. fitsaboana RNaseH:

Ny fitsaboana ny fanehoan-kevitry ny cDNA synthesis amin'ny RNaseH alohan'ny PCR dia mety hampitombo ny fahatsapana.Ho an'ny maodely sasany, heverina fa ny RNA ao amin'ny fanehoan-kevitry ny cDNA synthesis dia manakana ny famatorana ny vokatra fanamafisam-peo, izay mety hampitombo ny fahatsapana ny fitsaboana RNaseH.Amin'ny ankapobeny, ilaina ny fitsaboana RNaseH rehefa mampitombo ny maodely kendrena cDNA lava kokoa, toy ny scherose tuberous II ambany dika mitovy.Ho an'ity môdely sarotra ity, ny fitsaboana RNaseH dia nanatsara ny famantarana novokarin'ny SuperScript II na AMV-synthesized cDNA.Ho an'ny ankamaroan'ny fanehoan-kevitra RT-PCR, ny fitsaboana RNaseH dia azo atao, satria ny dingana denaturation PCR amin'ny 95 ° C amin'ny ankapobeny dia mamadika ny RNA ao amin'ny RNA: ADN complex.

6. Fanatsarana ny fomba fitiliana RNA kely:

Ny RT-PCR dia sarotra indrindra raha RNA kely ihany no misy.Ny glycogen ampiana ho mpitatitra mandritra ny fitokanana RNA dia manampy amin'ny fampitomboana ny vokatra santionany kely.Ny glycogen tsy misy RNase dia azo ampiana miaraka amin'ny fampidirana Trizol.Ny glycogène dia levona anaty rano ary azo tehirizina ao anaty rano miaraka amin'ny ARN mba hanampiana ny rotsak'orana manaraka.Ho an'ny santionany latsaky ny 50 mg ny tavy na 106 sela kolontsaina dia 250 μg/ml ny fatran'ny glycogen tsy misy RNase.

Ny fampidirana BSA acetylated amin'ny fanehoan-kevitry ny transcription mivadika amin'ny fampiasana SuperScript II dia mety hampitombo ny fahatsapana, ary ho an'ny RNA kely, ny fampihenana ny habetsaky ny SuperScript II ary ny fampidirana singa 40 amin'ny RNaseOut nuclease inhibitor dia mety hampitombo ny haavon'ny fitiliana.Raha ny glycogène dia ampiasaina amin'ny fizotry ny fitokanana RNA, dia mbola asaina manampy BSA na RNase inhibitor rehefa mampiasa SuperScript II ho an'ny fanehoan-kevitry ny transcription.

二, Ampitomboy ny RT-PCR manokana

1. Asynthesis CND:

Ny synthesis cDNA voalohany dia azo atomboka amin'ny alàlan'ny fomba telo samihafa, izay misy fiantraikany amin'ny habetsahana sy ny karazana cDNA voafantina.

Ny fomba voalohany tsy misy dikany no kely indrindra amin'ireo fomba telo.Ny primers dia mipetaka amin'ny toerana maro manerana ny transcript, miteraka cDNA fohy sy ampahany.Ity fomba ity dia matetika ampiasaina mba hahazoana ny filaharan'ny 5′ ary hahazoana cDNA avy amin'ny RNA templates miaraka amin'ny faritra misy rafitra faharoa na amin'ny toerana famaranana izay tsy azo averina amin'ny alàlan'ny transcriptase mivadika.Mba hahazoana ny cDNA lava indrindra, ny tahan'ny primers amin'ny RNA amin'ny santionany RNA tsirairay dia mila faritana amin'ny fomba empirically.Ny fifantohana fanombohana ny primer kisendrasendra dia eo amin'ny 50 ka hatramin'ny 250 ng isaky ny fanehoan-kevitra 20 μl.Koa satria ny cDNA voaforona avy amin'ny totalin'ny RNA mampiasa primer kisendrasendra dia ny ribosomal RNA voalohany indrindra, ny poly(A)+RNA dia amin'ny ankapobeny no voafidy ho modely.

Oligo (dT) primers dia voafaritra kokoa noho ny kisendrasendra primers.Izy io dia mitambatra amin'ny rambony poly(A) hita amin'ny faran'ny 3′ amin'ny ankamaroan'ny mRNA eukaryotic.Satria ny poly(A) + RNA dia eo amin'ny 1% hatramin'ny 2% amin'ny totalin'ny RNA, ny habetsahan'ny cDNA sy ny fahasarotan'ny cDNA dia kely kokoa noho ny amin'ny primer kisendrasendra.Noho ny maha manokana azy, ny oligo(dT) amin'ny ankapobeny dia tsy mitaky fanatsarana ny tahan'ny RNA amin'ny primers sy ny fifantenana poly(A)+.Aroso ny mampiasa 0.5μg oligo(dT) isaky ny rafitra fanehoan-kevitra 20μl.oligo(dT)12-18 dia mety amin'ny ankamaroan'ny RT-PCR.Ny ThermoScript RT-PCR System dia manolotra oligo(dT)20 noho ny fahamarinany mafana kokoa noho ny hafanan'ny incubation ambony kokoa.

Gene specific primers (GSP) no fototra manokana indrindra ho an'ny dingana fanodinana mivadika.Ny GSP dia oligonucleotide antisense izay afaka mampifangaro manokana amin'ny filaharan'ny kendrena RNA, fa tsy toy ny primer kisendrasendra na oligo(dT), izay miraikitra amin'ny RNA rehetra.Ny fitsipika mitovy amin'ny famolavolana ny PCR primer dia mihatra amin'ny famolavolana ny GSP amin'ny fanehoan-kevitry ny fandikana mivadika.Ny GSP dia mety ho toy ny filaharana mitovy amin'ny fanamafisam-peo izay mipetaka amin'ny faran'ny 3′-ny indrindra amin'ny mRNA, na ny GSP dia azo natao mba hametahana ny midina ambany amin'ny primer amplification mivadika.Ho an'ny lohahevitra sasany amplified, mihoatra ny iray antisense primer dia mila natao ho an'ny RT-PCR mahomby satria ny rafitra faharoa amin'ny RNA kendrena dia mety hisoroka ny fatorana voalohany.Aroso ny mampiasa 1 pmol antisense GSP amin'ny 20 μl voalohany-strand synthesis fanehoan-kevitra.

2. Ampitomboy ny mari-pana incubation ho an'ny transcription mivadika:

Mba hahazoana tombony feno amin'ny tombotsoan'ny GSP manokana, dia tokony hampiasaina ny transcriptase mivadika amin'ny thermostability ambony kokoa.Ny transcriptases mifamadika amin'ny thermotable dia azo ampidirina amin'ny mari-pana ambony kokoa mba hampitomboana ny herim-po.Ohatra, raha 55°C ny GSP iray, dia tsy ho ampiasaina amin'ny fomba feno ny mombamomba ny GSP raha AMV na M-MLV no ampiasaina amin'ny fandikana mivadika amin'ny 37°C.Na izany aza, ny SuperScript II sy ThermoScript dia azo atao amin'ny 50 ° C na ambony, izay hanafoana ny vokatra tsy voafaritra amin'ny mari-pana ambany kokoa.Ho an'ny mari-pamantarana ambony indrindra, ny fangaro RNA/primer dia azo afindra mivantana avy amin'ny mari-pana denaturation 65 ° C mankany amin'ny mari-pana incubation transcription mivadika ary ampidirina amin'ny fifangaroan'ny fanehoan-kevitra 2 × efa mafana (fanombohana mafana ny cDNA synthesis).Izany dia manampy amin'ny fisorohana ny fifamatorana fototra intermolecular amin'ny hafanana ambany.Ny fiovan'ny mari-pana maro ilaina amin'ny RT-PCR dia azo tsotsotra amin'ny alàlan'ny fampiasana cycler mafana.

3. Mampihena ny fandotoana ADN génomika:

Ny fahasarotana mety hitranga amin'ny RT-PCR dia ny fandotoana ny ADN génomika ao amin'ny RNA.Ny fampiasana fomba fitokanana RNA tsara, toy ny Trizol Reagent, dia hampihena ny habetsaky ny ADN génomika mandoto ny fanomanana RNA.Mba hisorohana ny vokatra azo avy amin'ny ADN génomika, ny ARN dia azo tsaboina amin'ny DNase I amin'ny ambaratonga amplification mba hanesorana ny ADN maloto alohan'ny hamerenana ny fandikana.Ny fandevonan-kanina DNase I dia natsahatra tamin'ny fampidirana ireo santionany tao amin'ny 2.0 mM EDTA nandritra ny 10 minitra tamin'ny 65 ° C.Ny EDTA dia afaka mi-chelate ny ion magnesium, manakana ny hydrolysis RNA miankina amin'ny magnesium ion amin'ny hafanana ambony.

Mba hanasarahana ny cDNA amplified amin'ny fandotoana ny vokatra fanamafisan'ny ADN génomika, ny primers dia azo natao mba hampisaraka ny exon ny tsirairay.Ny vokatra PCR azo avy amin'ny cDNA dia ho fohy kokoa noho ny azo avy amin'ny ADN genomika voapoizina.Fanampin'izany, ny fanandramana fanaraha-maso tsy misy fandikana mivadika dia natao tamin'ny môdely RNA tsirairay mba hamaritana raha avy amin'ny ADN na cDNA ny sombiny nomena.Ny vokatra PCR azo tsy misy transcription mivadika dia avy amin'ny génome.