• PCR dia fomba iray ampiasaina hanamafisana ny ADN avy amin'ny maodely ADN kely.RT-PCR dia mampiasa transcription mivadika hamokatra mody ADN avy amin'ny loharano RNA izay azo ampitomboina avy eo.
• Ny PCR sy RT-PCR dia matetika fanehoan-kevitra farany, raha ny qPCR sy RT-qPCR dia mampiasa ny kinetika ny tahan'ny synthesis vokatra mandritra ny fanehoan-kevitra PCR mba hamaritana ny habetsaky ny môdely misy.
• Ny fomba vaovao kokoa, toy ny PCR dizitaly, dia manome fatra tanteraka ny maodely ADN voalohany, fa ny fomba toy ny isothermal PCR dia mampihena ny filana fitaovana lafo vidy mba hanomezana vokatra azo antoka.

Ny fihetsiketsehan'ny rojo polymerase (PCR) dia teknika biolojia molekiola tsotra sy be mpampiasa mba hanamafisana sy hamantarana ny filaharan'ny ADN sy ARN.Raha ampitahaina amin'ny fomba nentim-paharazana amin'ny fametahana ny ADN sy ny fanamafisam-peo, izay mety maharitra andro maromaro, ny PCR dia mila ora vitsivitsy monja.Ny PCR dia tena saro-pady ary mila môdely faran'izay kely indrindra mba hahitana sy hanamafisana ny filaharana manokana.Ny fomba PCR fototra dia nandroso bebe kokoa tamin'ny fitiliana ADN sy ARN tsotra.Ity ambany ity dia nanome topimaso momba ny fomba PCR samihafa sy ny reagents omenay ao amin'ny Enzo Life Sciences ho an'ny filànao fikarohana.Kendrenay ny hanampy ireo mpahay siansa hiditra haingana amin'ny reagents PCR hampiasaina amin'ny tetikasa fikarohana manaraka!

PCR

Ho an'ny PCR mahazatra, ny hany ilainao dia polymerase ADN, magnesium, nucleotides, primers, ny maodely ADN hohamafisina, ary thermocycler.Ny mekanika PCR dia tsotra toy ny tanjony: 1) ADN miendrika roa (dsDNA) dia simbaina amin'ny hafanana, 2) ny primer dia mirindra amin'ny tady ADN tokana, ary 3) ny primer dia miitatra amin'ny ADN polymerase, ka miteraka dika roa amin'ny tady ADN tany am-boalohany.Ny fizotry ny denaturation, annealing, ary ny fanitarana ny maripana sy ny fotoana maromaro dia fantatra amin'ny hoe tsingerin'ny amplification iray (sary 1).

Ny dingana tsirairay amin'ny tsingerina dia tokony hohatsaraina ho an'ny môdely sy ny primer ampiasaina.Ity tsingerina ity dia miverimberina in-20-40 eo ho eo, ary ny vokatra nohamafisina dia azo anaovana fanadihadiana, matetika amin'ny gel agarose (sary 2).

Satria ny PCR dia fomba tena saro-pady ary kely dia kely no ilaina ho an'ny fanehoan-kevitra tokana, ny fanomanana ny master mix ho an'ny fanehoan-kevitra maromaro dia asaina.Ny fangaro master dia tsy maintsy afangaro tsara ary avy eo zaraina amin'ny isan'ny fanehoan-kevitra, mba hahazoana antoka fa ny fanehoan-kevitra tsirairay dia ahitana enzyme, dNTP, ary primer mitovy.Mpamatsy maro, toa an'i Enzo Life Sciences, no manolotra fangaro PCR izay efa misy ny zava-drehetra afa-tsy ny primer sy ny maodely ADN.

Ny faritra manankarena Guanine/Cytosine (manankarena GC) dia maneho fanamby amin'ny teknika PCR mahazatra.Ny filaharana manankarena GC dia marin-toerana kokoa noho ny filaharana misy votoaty GC ambany.Ankoatr'izay, ny filaharana manankarena amin'ny GC dia matetika mamorona rafitra faharoa, toy ny tadivavarana volo.Vokatr'izany dia sarotra ny misaraka tanteraka ny tady roa manankarena GC mandritra ny dingana denaturation.Noho izany, ny ADN polymerase dia tsy afaka mampifanaraka ny tady vaovao tsy misy sakana.Ny mari-pana denaturation ambony kokoa dia afaka manatsara izany, ary ny fanitsiana mankany amin'ny mari-pana fanaingoana avo kokoa sy ny fotoana fanariana fohy kokoa dia afaka manakana ny fatorana tsy voafaritra amin'ny primer manankarena GC.Ny reagents fanampiny dia afaka manatsara ny fanamafisana ny filaharana manankarena GC.Ny DMSO, ny glycerol ary ny betaine dia manampy amin'ny fanakorontanana ny rafitra faharoa vokatry ny fifandraisan'ny GC ary noho izany dia manamora ny fisarahana ny tady roa.

Hot Start PCR

Ny fampitomboana tsy voafaritra dia olana mety hitranga mandritra ny PCR.Ny ankamaroan'ny polymerase ADN izay ampiasaina amin'ny PCR dia miasa tsara indrindra amin'ny hafanana manodidina ny 68°C hatramin'ny 72°C.Ny anzima anefa dia afaka miasa amin'ny mari-pana ambany kokoa, na dia amin'ny ambaratonga ambany aza.Amin'ny mari-pana ambany lavitra ny mari-pana fanalana, ny primer dia afaka mamatotra tsy voafaritra ary mitarika amin'ny fanamafisana tsy voafaritra, na dia napetraka amin'ny ranomandry aza ny fanehoan-kevitra.Azo sorohina izany amin'ny alalan'ny fampiasana inhibitors polymerase izay misaraka amin'ny polymerase ADN raha vao tonga ny mari-pana iray, noho izany ny teny hoe PCR fanombohana mafana.Ny inhibitor dia mety ho antibody izay mamatotra ny polymerase sy ny denature amin'ny mari-pana denaturation voalohany (95 ° C matetika).

High Fidelity Polymerase

Na dia mihamatanjaka tsara amin'ny filaharan'ny môdely tany am-boalohany aza ny polymerase ADN, dia mety hitranga ny fahadisoana amin'ny fampifanarahana ny nucleotide.Ny tsy fitovian-kevitra amin'ny fampiharana toy ny kloning dia mety hiteraka transcript voatapaka, ary proteinina diso fandikana na tsy mavitrika any ambany.Mba hisorohana ireo tsy fifankahazoana ireo, ny polymerase miaraka amin'ny hetsika "fanamarinana" dia fantatra sy nampidirina tao amin'ny workflow.Ny polymerase proofreading voalohany, Pfu, dia fantatra tamin'ny 1991 tao amin'ny Pyrococcus furiosus.Ity enzyme Pfu ity dia manana hetsika exonuclease 3' hatramin'ny 5'.Rehefa mihamatanjaka ny ADN dia esorin'ny exonuclease ny nucleotides tsy mifanentana amin'ny faran'ny 3' amin'ny tady.Ny nucleotide marina dia soloina avy eo, ary mitohy ny synthesis ADN.Ny famantarana ny filaharan'ny nucleotide diso dia mifototra amin'ny fifandraisana mifamatotra amin'ny triphosphate nucleoside marina miaraka amin'ny anzima, izay ny fatorana tsy mahomby dia mampiadana ny synthesis ary mamela ny fanoloana marina.Ny asa fanitsiana ny Pfu polymerase dia miteraka fahadisoana vitsy kokoa amin'ny filaharana farany raha oharina amin'ny Taq DNA polymerase.Tao anatin'ny taona vitsivitsy izay, nisy anzima proofreading hafa, ary ny fanovana ny anzima Pfu tany am-boalohany dia natao mba hampihenana bebe kokoa ny tahan'ny fahadisoana mandritra ny fanamafisana ny ADN.

RT-PCR

Reverse transcription PCR, na RT-PCR, dia mamela ny fampiasana RNA ho modely.Ny dingana fanampiny dia ahafahana mamantatra sy mampitombo ny ARN.Ny ARN dia nadika ho ADN mifameno (cDNA), mampiasa transcriptase mivadika.Ny kalitao sy ny fahadiovan'ny môdely RNA dia tena ilaina amin'ny fahombiazan'ny RT-PCR.Ny dingana voalohany amin'ny RT-PCR dia ny synthesis ny hybrid ADN/RNA.Ny transcriptase mivadika koa dia manana fiasa RNase H, izay manimba ny ampahany RNA amin'ny hybrid.Ny molekiolan'ny ADN tokana tokana dia vita amin'ny asan'ny polymerase ADN miankina amin'ny transcriptase mivadika ho cDNA.Ny fahombiazan'ny fanehoan-kevitra voalohany dia mety hisy fiantraikany amin'ny fizotran'ny amplification.Manomboka eto, ny fomba PCR mahazatra dia ampiasaina hanamafisana ny cDNA.Ny fahafahana mamerina ny ARN ho cDNA amin'ny alàlan'ny RT-PCR dia manana tombony maro, ary ampiasaina voalohany indrindra amin'ny famakafakana ny fanehoana ny fototarazo.Ny RNA dia tady tokana ary tena tsy miovaova, izay mahatonga azy ho sarotra ny miasa.Matetika izy io no dingana voalohany amin'ny qPCR, izay mamaritra ny transcript RNA amin'ny santionany biolojika.

qPCR sy RT-qPCR

Quantitative PCR (qPCR) dia ampiasaina hamantarana, hamaritana ary hamantatra ny asidra nokleika ho an'ny fampiharana maro.Ao amin'ny RT-qPCR, ny transcript RNA dia matetika nofaritana amin'ny alàlan'ny famadihana azy ireo amin'ny cDNA aloha, araka ny voalaza etsy ambony, ary avy eo dia atao ny qPCR.Toy ny amin'ny PCR mahazatra, ny ADN dia ampitomboina amin'ny dingana telo miverimberina: denaturation, annealing ary elongation.Na izany aza, amin'ny qPCR, ny fametahana fluorescent dia mamela ny fanangonana angon-drakitra rehefa mandroso ny PCR.Ity teknika ity dia manana tombony maro noho ny karazana fomba sy simika misy.

Ao amin'ny qPCR mifototra amin'ny loko (maitso matetika), ny fametahana fluorescent dia mamela ny fanombanana ny molekiola ADN ampitomboina amin'ny fampiasana loko mamatotra dsDNA.Isaky ny tsingerina dia refesina ny fluorescence.Ny mari-pamantarana fluorescence dia mitombo mifandanja amin'ny habetsahan'ny ADN averina.Noho izany, ny ADN dia voaisa amin'ny "fotoana tena izy" (sary 3).Ny tsy fahampian'ny qPCR mifototra amin'ny loko dia ny tanjona iray ihany no azo jerena amin'ny fotoana iray ary ny loko dia hamatotra ny ds-DNA rehetra misy ao amin'ny santionany.

Ao amin'ny qPCR mifototra amin'ny probe, lasibatra maro no azo tsikaritra miaraka amin'ny santionany tsirairay, saingy mitaky fanatsarana sy famolavolana probe manokana ampiasaina ho fanampin'ny primers izany.Misy karazana probe maromaro misy, fa ny karazany mahazatra indrindra dia ny hydrolysis probe, izay misy fluorophore sy quencher.Ny fifindran'ny angovo azo avy amin'ny fluorescence (FRET) dia manakana ny famoahana ny fluorophore amin'ny alàlan'ny famonoan-tena raha mbola tsy misy ny fanadihadiana.Na izany aza, mandritra ny fanehoan-kevitry ny PCR, ny probe dia hydrolyzed mandritra ny fanitarana voalohany sy ny fanamafisana ny filaharana manokana mifamatotra aminy.Ny fiparitahan'ny probe dia manasaraka ny fluorophore amin'ny famonoana ary miteraka fitomboan'ny fluorescence miankina amin'ny amplification (sary 4).Noho izany, ny mari-pandrefesana fluorescence avy amin'ny fanehoan-kevitra qPCR mifototra amin'ny probe dia mifandanja amin'ny habetsaky ny filaharana kendrena amin'ny fanadihadiana misy ao amin'ny santionany.Satria ny qPCR mifototra amin'ny probe dia voafaritra kokoa noho ny qPCR mifototra amin'ny loko, dia matetika ny teknolojia ampiasaina amin'ny fitiliana diagnostika mifototra amin'ny qPCR.

Isothermal Amplification

Ny teknikan'ny PCR voalaza etsy ambony dia mitaky fitaovana thermocycling lafo vidy mba hampiakatra sy hidina marina ny mari-pana ao amin'ny efitrano ho an'ny dingana denaturation, annealing ary fanitarana.Misy teknika maromaro novolavolaina izay tsy mila fitaovana mazava tsara toy izany ary azo atao amin'ny fandroana rano tsotra na ao anatin'ny sela mahaliana.Ireo teknika ireo dia antsoina hoe amplification isothermal ary miasa mifototra amin'ny amplification exponential, linear, na cascade.

Ny karazana amplification isothermal malaza indrindra dia ny amplification isothermal loop-mediated, na LAMP.LAMP dia mampiasa amplification exponential amin'ny 65⁰C mba hanamafisana ny ADN na RNA modely.Rehefa manao LAMP, ny primer efatra ka hatramin'ny enina mifameno amin'ny faritra misy ny ADN kendrena dia ampiasaina miaraka amin'ny polymerase ADN mba hamoronana ADN vaovao.Ny roa amin'ireo primers ireo dia manana filaharana maimaim-poana izay mahafantatra ny filaharana ao amin'ny primer hafa ary mamatotra azy ireo, mamela ny rafitra "loop" hiforona ao amin'ny ADN vao novolavolaina izay manampy amin'ny fanalefahana ny primer amin'ny fihodinana fanamafisam-peo manaraka.Ny LAMP dia azo jerena amin'ny fomba maro, ao anatin'izany ny fluorescence, electrophoresis gel agarose, na colorimetry.Ny fanamorana ny fijerena sy ny fahitana ny fisiana na ny tsy fisian'ny vokatra amin'ny alàlan'ny colorimetry sy ny tsy fisian'ny fitaovana lafo vidy dia nahatonga ny LAMP ho safidy mety amin'ny fitiliana SARS-CoV-2 any amin'ny faritra tsy misy fitiliana laboratoara klinika, na fitahirizana sy fitaterana santionany. dia tsy azo atao, na any amin'ny laboratoara izay tsy nanana fitaovana thermocycling PCR teo aloha.