Ny teknolojia fitiliana molekiola dia mampiasa fomba biolojia molekiola hamantarana ny fanehoana sy ny firafitry ny akora fototarazo ao amin'ny vatan'olombelona sy ny otrikaretina isan-karazany, mba hahatratrarana ny tanjon'ny faminaniana sy ny fitiliana aretina.

Tao anatin'ny taona vitsivitsy izay, miaraka amin'ny fanavaozana sy fanavaozana ny teknolojia diagnostika molekiola, ny fampiharana klinika momba ny diagnostika molekiola dia nanjary nivelatra sy lalina kokoa, ary ny tsenan'ny diagnostika molekiola dia niditra tao anatin'ny vanim-potoanan'ny fivoarana haingana.

Ny mpanoratra dia mamintina ny teknolojia diagnostika molekiola mahazatra eny an-tsena, ary mizara telo: ny ampahany voalohany dia mampiditra ny teknolojia PCR, ny tapany faharoa dia mampiditra ny teknolojia fanamafisana isothermal asidra nucleic, ary ny ampahany faharoa dia mampiditra ny teknolojia sequencing.

01

Fizarana I: Teknolojia PCR

Teknolojia PCR

Ny PCR (polymerase chain reaction) dia iray amin'ireo teknolojia fanamafisana ny ADN in vitro, izay manana tantara mihoatra ny 30 taona.

Ny teknolojia PCR dia nisava lalana tamin'ny 1983 nataon'i Kary Mullis avy any Cetus, Etazonia.Mullis dia nangataka patanty PCR tamin'ny 1985 ary namoaka ny taratasy akademika PCR voalohany momba ny Siansa tamin'io taona io ihany.Nahazo ny loka Nobel momba ny Chemistry i Mullis tamin'ny 1993.

Fitsipika fototra amin'ny PCR

Ny PCR dia afaka mampitombo ny sombintsombin'ny ADN kendrena mihoatra ny iray tapitrisa.Ny fitsipika dia ny hoe eo ambanin'ny catalyse ny ADN polymerase, ny ADN tadin'ny ray aman-dreny dia ampiasaina ho môdely, ary ny primer manokana dia ampiasaina ho toerana fanombohana ny fanitarana.Averina in vitro amin'ny alalan'ny dingana toy ny denaturation, annealing ary fanitarana.Ny dingan'ny ADN strand zanaka vavy mifameno amin'ny ADN modelin'ny ray aman-dreny.

Ny dingana PCR mahazatra dia mizara ho dingana telo:

1. Denaturation: Mampiasà mari-pana ambony hanasaraka ny tady ADN roa.Tapaka amin'ny hafanana ambony (93-98°C) ny fatoran'ny hidrôzenina eo amin'ny tady roa ADN.

2. Fametahana: Rehefa misaraka ny ADN misy tady roa, dia ampidinina ny mari-pana mba hahafahan'ilay primer mifatotra amin'ny ADN tokana.

3. Fanitarana: Ny polymerase ADN dia manomboka manambatra tady mifameno amin'ny tadin'ny ADN avy amin'ireo primer mifatotra rehefa midina ny mari-pana.Rehefa vita ny fanitarana, dia vita ny tsingerina iray, ary mitombo avo roa heny ny isan'ny sombintsombin'ny ADN.

Ny famerenana ireo dingana telo ireo in-25-35, dia hitombo be ny isan'ny sombintsombin'ny ADN.

Ny fahaiza-manaon'ny PCR dia ny hoe ny primer samihafa dia azo natao ho an'ny fototarazo kendrena samihafa, mba hahafahan'ireo sombin-taranaka kendrena ho azo ampitomboina ao anatin'ny fotoana fohy.

Hatreto dia azo zaraina ho sokajy telo ny PCR, dia ny PCR tsotra, ny PCR quantitative fluorescent ary ny PCR nomerika.

Ny taranaka voalohany amin'ny PCR mahazatra

Mampiasà fitaovana fanamafisam-peo PCR mahazatra mba hanamafisana ny fototarazo kendrena, ary avy eo ampiasao ny electrophoresis gel agarose hamantarana ny vokatra, ny fanadihadiana kalitao ihany no azo atao.

Ny tena fatiantoka ny taranaka voalohany PCR:

- Mora amin'ny fanamafisana tsy voafaritra sy valiny tsara diso.

-Maharitra ela ny fitiliana ary sarotra ny fandidiana.

-Ny fitiliana qualitative ihany no azo atao.

PCR quantitative fluorescence taranaka faharoa

Fluorescence quantitative PCR (Real-Time PCR), fantatra ihany koa amin'ny hoe qPCR, dia ampiasaina mba hanaraha-maso ny fanangonan-karena ny amplified vokatra amin'ny alalan'ny fanangonan-karena ny fluorescent famantarana amin'ny alalan'ny fanampiana fluorescent probes izay afaka manondro ny fandrosoan'ny rafitra fanehoan-kevitra, ary hitsara ny vokatra amin'ny alalan'ny fluorescence curve, ary azo isaina amin'ny fanampian'ny Cq sanda sy ny fenitra curve.

Satria ny teknolojia qPCR dia tanterahana amin'ny rafitra mihidy, mihena ny mety hisian'ny fandotoana, ary ny mari-pamantarana fluorescence dia azo araha-maso amin'ny fitiliana quantitative, ka izany no be mpampiasa indrindra amin'ny fampiharana klinika ary lasa teknolojia lehibe indrindra amin'ny PCR.

Ny akora fluorescent ampiasaina amin'ny PCR fatran'ny fluorescent tena izy dia azo zaraina ho: probe fluorescent TaqMan, fanilo molekiola ary loko fluorescent.

1) TaqMan fluorescent probe:

Mandritra ny fanamafisam-peo PCR, misy probe fluorescent manokana ampiana rehefa manampy primers roa.Ny probe dia oligonucleotide, ary ny tendrony roa dia misy marika miaraka amin'ny vondrona fluorescent mpanao gazety sy vondrona fluorescent quencher.

Rehefa tsy misy dikany ny probe, ny famantarana fluorescent avoakan'ny vondrona mpanao gazety dia lasan'ny vondrona famonoana;mandritra ny fanamafisam-peo PCR, ny hetsika exonuclease 5′-3′ an'ny Taq enzyme dia manapaka sy manimba ny probe, ka mahatonga ny mpanao gazety fluorescent group sy quencher. Ny vokatra PCR.

2) SYBR fluorescent loko:

Ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitry ny PCR dia ampiana ny lokon'ny fluorescent SYBR.Taorian'ny fandokoana fluorescent SYBR dia tsy nampidirina manokana ao amin'ny tady roa ADN, dia mamoaka famantarana fluorescent izy.Ny molekiolan'ny lokon'ny SYBR izay tsy tafiditra ao anatin'ny rojo dia tsy hamoaka famantarana fluorescent, ka hiantoka ny famantarana ny fluorescent Ny fitomboan'ny vokatra PCR dia mifanaraka tanteraka amin'ny fitomboan'ny vokatra PCR.Ny SYBR dia mifamatotra amin'ny ADN mitongilana roa ihany, noho izany dia azo ampiasaina hamaritana raha voafaritra ny fihetsiky ny PCR.

3) Fanilo molekiola

Izy io dia probe oligonucleotide misy marika roa misy marika roa izay mamorona firafitry ny volo misy fototra 8 eo amin'ny tendrony 5 sy 3.Ny filaharan'ny asidra nokleika amin'ny tendrony roa dia mifameno, ka mahatonga ny vondrona fluorescent sy ny vondrona famonoana ho henjana.Close, dia tsy hamokatra fluorescence.

Aorian'ny famoahana ny vokatra PCR, mandritra ny dingan'ny fanodinana, ny tapany afovoan'ny molekiola dia ampiarahina amin'ny filaharan'ny ADN manokana, ary ny fototarazo fluorescent dia misaraka amin'ny fototarazo famonoana mba hamokarana fluorescence.

Ny tsy fahampiana lehibe amin'ny PCR andiany faharoa:

Mbola tsy ampy ny fahatsapana, ary tsy marina ny fahitana ireo santionany ambany.

Misy fiantraikany amin'ny soatoavina fototra, ary ny vokatra dia mety ho tratran'ny fitsabahana.

PCR nomerika taranaka fahatelo

Digital PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) dia manao kajy ny laharan'ny dika mitovy amin'ny filaharana kendrena amin'ny alàlan'ny fitsirihana ny teboka farany, ary afaka manao fitsirihana fatra tanteraka tsy misy fanaraha-maso anatiny sy curve mahazatra.

Ny PCR nomerika dia mampiasa ny fitsirihana ny endpoint ary tsy miankina amin'ny sandan'ny Ct (tokona amin'ny tsingerina), noho izany dia tsy dia misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny amplification ny fanehoan-kevitry ny PCR nomerika, ary mihatsara ny fandeferana amin'ny inhibitors fanehoan-kevitra PCR, miaraka amin'ny fahitsiana sy ny famerenana indray.

Noho ny toetran'ny fahatsapan-tena ambony sy ny fahitsiana avo lenta, dia tsy mora manelingelina amin'ny alàlan'ny PCR fanehoan-kevitra inhibitors, ary afaka hahatratra ny tena quantification tanteraka tsy misy fenitra vokatra, izay lasa fikarohana sy ny fampiharana hotspot.

Araka ny endrika isan-karazany ny vondrona fanehoan-kevitra, dia azo zaraina ho telo karazana: microfluidic, chip sy droplet rafitra.