Ny sanda Ct no endrika fanehoana vokatra manan-danja indrindra amin'ny PCR quantitative fluorescent.Ampiasaina hanisa ny fahasamihafan'ny fanehoana ny fototarazo na ny laharan'ny kopian'ny fototarazo.Ka inona ny sandan'ny Ct amin'ny fatran'ny fluorescence heverina ho mitombina?Ahoana no hiantohana ny sanda Ct mahomby?
Inona no atao hoe Ct Value?
Nandritra ny dingan'ny fanamafisam-peo qPCR, ny isan'ny tsingerin'ny amplification mifanaraka amin'izany (Treshold Cycle) rehefa tonga eo amin'ny tokonam-baravaran'ny fluorescence ny famantarana ny fluorescence amin'ny vokatra ampitomboina.C dia midika hoe Cycle ary T dia midika hoe Threshold.Raha tsorina, ny sandan'ny Ct dia ny isan'ny tsingerina mifanitsy amin'ny fotoana hahatongavan'ny fanamafisam-peo voalohany amin'ny vokatra sasany ao amin'ny qPCR.Hazavaina bebe kokoa any aoriana ilay antsoina hoe “vokatra sasany”.
Inona no atao hoe sanda Ct?
1. Fifandraisana eo amin'ny amplification exponential, habetsan'ny môdely ary sanda Ct
Ny tsara indrindra, ny fototarazo ao amin'ny qPCR dia angonina amin'ny alàlan'ny fanamafisana ny exponential aorian'ny tsingerina maromaro.Ny fifandraisana misy eo amin'ny isan'ny tsingerin'ny fanamafisam-peo sy ny habetsahan'ny vokatra dia: Habetsan'ny vokatra nohamafisina = habetsan'ny maodely voalohany × (1+En) laharan'ny tsingerina.Na izany aza, ny fanehoan-kevitra qPCR dia tsy ao anatin'ny toe-javatra tsara indrindra.Rehefa mahatratra "habetsan'ny vokatra sasany" ny habetsahan'ny vokatra ampitomboina, ny isan'ny tsingerina amin'izao fotoana izao dia ny sanda Ct, ary ao anatin'ny vanim-potoana fanamafisam-peo.Ny fifandraisana misy eo amin'ny sandan'ny Ct sy ny habetsaky ny môdely fanombohana: Misy fifandraisana andalana eo amin'ny sandan'ny Ct an'ny môdely sy ny logaritma amin'ny laharan'ny kopia fanombohana ny môdely.Arakaraky ny avo kokoa ny fifantohana môdely voalohany, ny kely kokoa ny sanda Ct;ny ambany ny fifantohana môdely voalohany, ny lehibe kokoa ny sanda Ct.
2.Amplification curve, fluorescence tokonam-baravarana sy ny sasany PCR vokatra
Ny habetsaky ny vokatra fanamafisam-peo qPCR dia aseho mivantana amin'ny endrika famantarana fluorescent, izany hoe ny curve amplification.Amin'ny dingana voalohany amin'ny PCR, ny fanamafisana dia eo ambanin'ny fepetra tsara indrindra, ny isan'ny tsingerina dia kely, ny fanangonana vokatra dia kely, ary ny haavon'ny fluorescence dia tsy azo avahana mazava tsara amin'ny afara fluorescence.Aorian'izany dia mitombo ny fluorescence ary miditra amin'ny dingana exponential.Ny habetsaky ny vokatra PCR dia azo tsikaritra amin'ny fotoana iray rehefa ao anatin'ny dingana exponential fotsiny ny fihetsiky ny PCR, izay azo ampiasaina ho "vokatra maromaro", ary azo tsoahina avy amin'izany ny votoatin'ny môdely voalohany.Noho izany, ny hamafin'ny famantarana fluorescence mifanitsy amin'ny habetsaky ny vokatra dia ny tokonam-baravarana fluorescence.
Amin'ny dingana faramparan'ny PCR, ny curve amplification dia tsy mampiseho fanamafisam-peo intsony, ary miditra amin'ny dingana tsipika sy ny lembalemba.
3.Reproducibility ny soatoavina Ct
Rehefa mahatratra ny isan'ny tsingerin'ny sanda Ct ny tsingerin'ny PCR dia vao niditra ny vanim-potoana fanamafisam-peo marina.Amin'izao fotoana izao, ny fahadisoana kely dia tsy nohamafisina, noho izany dia tsara ny reproducibility ny sanda Ct, izany hoe, ny môdely iray ihany no ampitomboina amin'ny fotoana samy hafa na amin'ny fantsona samihafa amin'ny fotoana iray ihany.Fanamafisana, ny sanda Ct azo dia tsy miova.
1. Fahombiazana amin'ny fanamafisana En
Ny fahombiazan'ny amplification PCR dia manondro ny fahombiazan'ny polymerase mamadika ny fototarazo ho amplicon ho amplicon.Ny fahombiazan'ny amplification rehefa molekiola ADN iray miova ho molekiola ADN roa dia 100%.Ny fahombiazan'ny amplification dia matetika aseho amin'ny hoe En.Mba hanamorana ny famakafakana ireo lahatsoratra manaraka, dia ampidirina fohifohy ireo lafin-javatra izay misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny amplification.
| Antony misy fiantraikany | fanazavana | Ahoana no hitsarana? |
| A. PCR inhibitors | 1. Ny ADN môdely dia misy akora manakana ny fihetsiky ny PCR, toy ny proteinina na savony.2. Ny cDNA aorian'ny transcription mivadika dia misy fitambarana RNA na RT reagent singa be dia be, izay mety hanakana ny fihetsiky ny PCR manaraka. | 1. Na misy loto dia azo tsaraina amin'ny fandrefesana ny tahan'ny A260/A280 sy A260/A230 na RNA electrophoresis.2. Na levona ny cDNA araka ny tahan'ny sasany aorian'ny fandikana mivadika. |
| B. Famolavolana voalohany tsy mety | Ny primers dia tsy miasa tsara | Jereo ny primers raha misy primer-dimer na hairpins, tsy mifanaraka, ary indraindray mandrakotra ny endrika intronic. |
| C. Famolavolana programa fanehoan-kevitra PCR tsy mety | 1. Tsy afaka manao anneau ny primer2. Tsy ampy ny famoahana ny ADN polymerase 3. Nihena ny hetsika ADN polymerase avo lenta amin'ny fotoana maharitra | 1. Ny mari-pana annealing dia ambony noho ny sandan'ny TM an'ny primer2. Fohy loatra ny fotoana alohan'ny denaturation 3. Lava loatra ny fotoana isaky ny dingana amin'ny fizotran'ny fanehoan-kevitra |
| D. Tsy ampy ny fampifangaroana ny reagents na ny fahadisoana pipetting | Ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra, ny fifantohana eo an-toerana ny singa fanehoan-kevitra PCR dia avo loatra na tsy mitovy, ka miteraka tsy exponential amplification ny PCR amplification. | |
| E. Amplicon Length | Ny halavan'ny amplicon dia lava loatra, mihoatra ny 300bp, ary ambany ny fahombiazan'ny amplification | Hamarino fa eo anelanelan'ny 80-300bp ny halavan'ny amplicon |
| F. Ny fiantraikan'ny reagents qPCR | Ny fifantohan'ny ADN polymerase ao amin'ny reagent dia ambany na ny fifantohan'ny ion ao amin'ny buffer dia tsy azo atao tsara, ka mahatonga ny asan'ny enzyme Taq tsy mahatratra ny ambony indrindra. | Famaritana ny fahombiazan'ny amplification amin'ny curve mahazatra |
2. Ny sandan'ny Ct
Ny sanda Ct dia eo amin'ny 15-35.Raha latsaky ny 15 ny sandan'ny Ct, dia heverina fa ao anatin'ny vanim-potoanan'ny baseline ny amplification ary tsy nahatratra ny fe-potoanan'ny fluorescence.Ny tsara indrindra dia misy fifandraisana tsipika eo amin'ny sanda Ct sy ny logaritma amin'ny laharan'ny kopia voalohany amin'ny môdely, izany hoe ny curve mahazatra.Amin'ny alàlan'ny curve mahazatra, rehefa 100% ny fahombiazan'ny amplification, dia manodidina ny 35 ny sandan'ny Ct kajy amin'ny fanombanana ny laharan'ny dika mitovy amin'ny fototarazo. Raha mihoatra ny 35 izany, ny laharan'ny kopia voalohany amin'ny môdely dia ara-teorika latsaky ny 1, izay azo heverina ho tsy misy dikany.
Ho an'ny karazana Ct isan-karazany, noho ny fahasamihafan'ny laharan'ny kopian'ny fototarazo sy ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo amin'ny habetsahan'ny môdely voalohany, dia ilaina ny manao curve manara-penitra ho an'ny fototarazo ary manao kajy ny salan'isa hita maso ny fototarazo.
3. Ny fiantraikan'ny sanda Ct
Avy amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny isan'ny tsingerin'ny fanamafisam-peo sy ny habetsahan'ny vokatra: ny habetsahan'ny vokatra ampitomboina = ny habetsaky ny laharan'ny tsingerin'ny voalohany × (1+En), dia hita fa ao anatin'ny fepetra tsara indrindra dia hisy fiantraikany ratsy eo amin'ny sandan'ny Ct ny habetsahan'ny môdely voalohany sy ny En.Ny fahasamihafan'ny kalitaon'ny môdely na ny fahombiazan'ny fanamafisana dia hahatonga ny sandan'ny Ct ho lehibe loatra na kely loatra.
4. Lehibe loatra na kely loatra ny sanda Ct
Fotoana fandefasana: Feb-22-2023
