PCR no teknolojia fampitomboana asidra nokleika be mpampiasa indrindra ary ampiasaina betsaka noho ny fahatsapany sy ny maha-tokana azy.Na izany aza, ny PCR dia mitaky denaturation mafana miverimberina ary tsy afaka manala ny fetran'ny fiankinan-doha amin'ny fitaovana sy ny fitaovana, izay mametra ny fampiharana azy amin'ny fitiliana eny amin'ny klinika.

Nanomboka tamin'ny fiandohan'ny taona 1990, laboratoara maro no nanomboka namolavola teknolojia fanamafisam-peo tsy tapaka izay tsy mitaky denaturation mafana.Ankehitriny dia namolavola teknolojia fanamafisam-peo isothermal izy ireo, teknolojia fanamafisam-peo isothermal fanoloana tady, teknolojia fanamafisam-peo isothermal faribolana, ary fiankinan-doha amin'ny filaharana asidra nucleic.Isothermal amplification teknolojia sy ny teknolojia hafa. 

Loop-mediated isothermal amplification

Ny fitsipiky ny amplification dia mifototra amin'ny hoe ny ADN dia ao anatin'ny equilibrium mavitrika amin'ny 65 ° C.Rehefa misy primer dia mitambatra fototra ary miitatra amin'ny ampahany mifameno amin'ny ADN misy tady roa, dia hisaraka ny tady hafa ary ho lasa tady tokana.

Amin'io mari-pana io, ny ADN dia mampiasa primer manokana 4 hiantehitra amin'ny polymerase ADN mamindra tady mba hahatonga ny synthesis ny ADN fifindran'ny tady hivezivezy tsy tapaka.

Farito aloha ny faritra 6 manokana F3, F2, F1, B1, B2, B3 amin'ny fototarazo kendrena, ary avy eo dia manamboara fototra 4 mifototra amin'ireo faritra 6 manokana ireo (araka ny aseho eo amin'ny sary etsy ambany):

Ny primer anatiny (FIP) dia ahitana ny F1c sy F2.

Ny primer anatiny mihemotra (BIP) dia ahitana ny B1c sy B2, ary ny TTTT dia ampiasaina ho toy ny spacer eo afovoany.

Ny primer ivelany F3 sy B3 dia ahitana faritra F3 sy B3 amin'ny fototarazo kendrena.

Ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra LAMP, ny fifantohan'ny primer anatiny dia im-betsaka noho ny an'ny primer ivelany.Ny primer anaty dia atambatra aloha amin'ny tady môdely mba hanambatra kofehy mifameno mba hamorona tady roa ADN.Aorian'izay, ny primer ivelany dia atambatra amin'ny kofehy môdely mba hamorona tady roa ADN.Eo ambanin'ny asan'ny BstDNA polymerase, dia mivoaka ny tady mifameno novolavolain'ny primer anatiny.Taorian'ny fanehoan-kevitra maromaro, ny kofehy mifameno dia mamorona tady ADN tokana miaraka amin'ny rafitra dumbbell.

Ny firafitry ny dumbbell ADN ny tady tokana dia ampiasaina ho môdely mba hamoronana tsy tapaka ADN firafitry ny tadin-davenona misy fiafarana misokatra.Ny primer anatiny sy ivelany dia mitarika ny ADN firafitry ny tadin-davenona tetezamita mba handalo tsy an-kijanona ny fifindran'ny tady sy ny fanehoan-kevitry ny fanitarana, ary amin'ny farany dia mamorona rafitra tadin-damosina maro samy hafa ny halavany.ADN mifangaro.

Ny tombony sy ny tsy fahampian'ny fanamafisana isothermal amin'ny loop-mediated

Ny tombony amin'ny LAMP:

(1) Fahombiazana avo lenta, izay afaka mampitombo tsara ny dika mitovy 1-10 amin'ny fototarazo kendrena ao anatin'ny 1h, ary ny fahombiazan'ny amplification dia 10-100 heny noho ny PCR mahazatra.

(2) Ny fotoana fanehoan-kevitra dia fohy, ny specificity dia matanjaka, ary tsy misy fitaovana manokana ilaina.

Ny tsy fahampian'ny LAMP:

(1) Ny fepetra takiana amin'ny primer dia avo indrindra.

(2) Ny vokatra nohamafisina dia tsy azo ampiasaina amin'ny kloning sy filaharana, fa azo ampiasaina amin'ny fitsarana ihany.

(3) Noho ny fahatsapany mafy dia mora ny mamorona aerosol, ka miteraka vokatra diso ary misy fiantraikany amin'ny valin'ny fitsapana.

Sfanitarana ny fifindran'ny trand

Ny fanamafisana ny fifindran'ny tady (SDA) dia teknika fanamafisana ny ADN isothermal in vitro mifototra amin'ny fanehoan-kevitra enzymatic natolotry ny manam-pahaizana amerikana Walker tamin'ny 1992.

Ny rafitra fototry ny SDA dia misy endonuclease famerana, polymerase ADN miaraka amin'ny hetsika fifindran'ny tady, primer roa, dNTP, ary ion kalsioma sy magnesium ary rafitra buffer.

Ny fitsipiky ny fanamafisana ny fifindran'ny tady dia mifototra amin'ny filaharan'ny fanekena endonuclease famerana simika novaina amin'ny faran'ny ADN.Ny endonuclease dia manokatra ny banga amin'ny tady ADN amin'ny toerana ahafantarana azy, ary ny polymerase ADN dia manitatra ny elanelana 3′ End ary manolo ny tady ADN manaraka.

Ny tady ADN tokana nosoloina dia azo atambatra amin'ny primers ary miitatra ho tady roa amin'ny alàlan'ny ADN polymerase.Ity dingana ity dia miverimberina tsy tapaka, mba hanamafisana tsara ny filaharana tanjona.

Ny tombony sy ny tsy fahampian'ny teknolojia fanamafisam-peo amin'ny fifindran'ny tady

Ny tombony amin'ny SDA:

Ny fahombiazan'ny amplification dia avo, ny fotoana fanehoan-kevitra dia fohy, ny specificity dia matanjaka, ary tsy mila fitaovana manokana.

Ny tsy fahampian'ny SDA:

Ny vokatra dia tsy fanamiana, ary ny vokatra tokana tokana sy avo roa heny dia vokarina ao amin'ny tsingerin'ny SDA, ary tsy maintsy hitranga ny tailing rehefa hita amin'ny alàlan'ny electrophoresis.

Ramplification boribory olling

Ny fanamafisam-peo mihodinkodina (RCA) dia atolotra amin'ny alàlan'ny fanaovana sary amin'ny fomba fanaovana kopia ADN avy amin'ny zavamananaina pathogen amin'ny alàlan'ny faribolana mihodina.Izy io dia manondro ny fampiasana ADN boribory tokana ho toy ny môdely amin'ny mari-pana tsy tapaka, ary polymerase ADN manokana (toy ny Phi29) ) Eo ambanin'ny hetsika ny synthesis ADN boribory mihodinkodina mba hahatratrarana ny fanamafisana ny fototarazo kendrena.

RCA dia azo zaraina ho linear amplification sy exponential amplification.Ny fahombiazan'ny linear RCA dia mety hahatratra 10⁵fotoana, ary mety hahatratra 10 ny fahombiazan'ny RCA exponential⁹fotoana.

Ny fanavahana tsotra, araka ny asehon'ny sary etsy ambany, ny amplification linear a dia mampiasa primer 1 ihany, ny amplification exponential b dia manana primer 2.

Linear RCA dia antsoina koa hoe single primer RCA.Ny primer dia mifatotra amin'ny ADN boribory ary miitatra amin'ny asan'ny ADN polymerase.Ny vokatra dia tady tokana tsipika miaraka amin'ny filaharana miverimberina in'arivony heny ny halavan'ny tadivavarana tokana.

Koa satria ny vokatra amin'ny linear RCA dia mifandray hatrany amin'ny fanombohana voalohany, ny fanamafisana mora ny famantarana dia tombony lehibe.

RCA exponential, fantatra ihany koa amin'ny anarana hoe Hyper branched amplification HRCA (Hyper branched RCA), amin'ny RCA exponential, ny primer iray dia manamafy ny vokatra RCA, ny primer faharoa dia mifamatotra amin'ny vokatra RCA ary manitatra, ary ny fanoloana dia efa mifamatotra amin'ny vokatra RCA Ny primer ambany dia manitatra ny tady, ary mamerina ny fanitarana sy fanoloana mba hamokarana vokatra RCA dendritic.

Ny tombony sy ny fatiantoka amin'ny fanamafisana ny asidra nucleic boribory boribory

Ny tombony amin'ny RCA:

Avo saro-pady, tsara specificity ary mora miasa.

Ny tsy fahampian'ny RCA:

Olana any ambadika mandritra ny fisavana famantarana.Mandritra ny fihetsiketsehan'ny RCA, ny probe padlock tsy miparitaka sy ny ADN na RNA modely amin'ny probe tsy voafatotra dia mety hiteraka famantarana ambadika. 

Namplification mifototra amin'ny filaharan'ny ucleicacid

Fanamafisana mifototra amin'ny filaharan'ny asidra nukleika (NASBA) dia teknolojia vaovao novolavolaina tamin'ny alàlan'ny PCR.Fanamafisana asidra nokleika mitohy sy isothermal izy io, tarihin'ny primer roa miaraka amin'ny filaharan'ny mpanentana T7.Ny teknolojia dia afaka mampitombo ny RNA môdely amin'ny in-109 eo ho eo ao anatin'ny 2 ora, izay avo 1000 heny noho ny fomba PCR mahazatra ary tsy mila fitaovana manokana.

Ity teknôlôjia ity dia nampiasaina ho an'ny fitiliana haingana ny aretina raha vao niseho izany, ary maro ny orinasa mampiasa an'io fomba io amin'ny kitapo fitiliana RNA.

Na dia afaka mampiasa teknolojia PCR transcription mivadika ihany koa aza ny fanamafisana ny RNA, dia manana tombony manokana ny NASBA: azo tanterahina amin'ny toe-javatra tsy miovaova ny mari-pana, ary miorina sy marina kokoa noho ny teknolojia PCR nentim-paharazana.

Ny fanehoan-kevitra dia eo amin'ny 41 degre Celsius ary mitaky AMV (avian myeloblastose virus) reverse transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase ary mpivady voalohany mba hamitana.

Ny dingana dia ahitana indrindra:

Ny primer mandroso dia misy ny filaharana mifameno amin'ny mpanentana T7.Mandritra ny fanehoan-kevitra dia mifatotra amin'ny tadin'ny RNA ny primer mandroso ary entin'ny enzyme AMV mba hamorona tady roa ADN-RNA.

Ny RNase H dia mandevona ny RNA ao amin'ny tady roa hybrid ary mitazona ny ADN tokana.

Eo ambanin'ny asan'ny reverse primer sy ny enzyme AMV, dia miforona ny tady roa ADN misy ny filaharan'ny mpanentana T7.

Eo ambanin'ny asan'ny T7 RNA polymerase, dia vita ny fizotran'ny transcription ary misy RNA kendrena be dia be.

Ny tombony amin'ny NASBA:

(1) Ny voalohany dia manana filaharan'ny mpanentana T7, fa ny ADN mitongilana roa avy any ivelany dia tsy manana filaharan'ny mpanentana T7 ary tsy azo ampitomboina, noho izany dia manana toetra manokana sy fahatsapana avo lenta ity teknolojia ity.

(2) Ny NASBA dia mampiditra mivantana ny fizotran'ny transcription mivadika amin'ny fanehoan-kevitry ny fanamafisana, manafoana ny fotoana fanehoan-kevitra.

Ny tsy fahampian'ny NASBA:

(1) Ny singa fanehoan-kevitra dia sarotra kokoa.

(2) Anzima telo karazana no ilaina mba hahatonga ny vidin'ny fanehoan-kevitra ambony kokoa.