RT-qPCR no fanandramana fototra momba ny biolojia molekiola, ary tsy maintsy fantatry ny rehetra izany.Anisan'izany ny dingana telo indrindra: ny fitrandrahana RNA, ny fandikana miverina amin'ny cDNA, ary ny PCR quantitative fluorescent tena izy.Tsy manampy izany, inona no mitranga?Azo inoana fa misy olana amin'nyny andrana transcription mivadika!Na dia toa tsy mila manampy RNA, dNTP, primers, ary dNTP fotsiny aza ny fanandramana transcription mivadikareverse transcriptasemankany amin'ny fantsona centrifuge ary afangaro tsara, fa amin'ny dingan'ny fandidiana tena izy dia mbola misy tsipiriany maro tokony hodinihina.Andao hianatra momba izany!

Ahoana no hitsarana ny kalitaon'ny ARN?
Mba hahazoana cDNA dia zava-dehibe ny kalitaon'ny ARN!Ny kalitaon'ny ARN dia azo jerena amin'ny lafiny roa:
(1) RNA tsy mivadika:Ny fahamarinan'ny ARN dia azo hamarinina amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel agarose. Raha raisina ho ohatra ny eukaryotes, ny totalin'ny ARN dia manana tarika telo mazava tsara, ny lanjan'ny molekiola manomboka amin'ny lehibe ka hatramin'ny kely dia 28S, 18S, ary 5S, ary ny 28S dia avo roa heny noho ny 18S;raha misy tarika telo hita, fa ny karazana tarika dia manjavozavo na Diffusion dia midika fa ny ARN dia simba amin'ny ampahany.Amin'izao fotoana izao, azafady ataovy avy hatrany ny fanehoan-kevitra mivadika ary ampitomboy araka ny tokony ho izy ny fampidirana môdely;raha bandy manana lanja molekiola kely na tsy misy bandy ihany no hita dia simba tanteraka ny RNA ary mila esorina indray.Ny Agilent 2100 dia manondro ny fahamendrehan'ny RNA miaraka amin'ny diagrama ambony sy ny sandan'ny RIN.Raha tsy misy ny asidra nokleika dia fisaka ny tsipika fototra amin'ny electropherogram;raha simba be ny asidra nokleika, dia tsy mitovy ny baseline ary miseho ny tampon'ny fahasimbana bebe kokoa;ny lanjan'ny RIN dia maneho ny fahamendrehan'ny RNA, ao anatin'ny 0-10, ny lehibe kokoa ny sandany, ny tsara kokoa ny kalitaon'ny ARN.Eny, ny ambony ny ambaratongam-fahafenoana.
(2) Fahadiovan'ny ARN:Ny tahan'ny OD260/280 dia azo fantarina amin'ny alàlan'ny spectrophotometry UV.Raha eo anelanelan'ny 1.9 sy 2.1 ny tahan'ny OD260/280 dia tena tsara ny fahadiovana.
Ny ADN génomika sisa dia mety hitarika amin'ny vokatra tsy marina
Rehefa alaina ny ARN dia mety hifangaro amin'ny ADN genomika (gDNA) izay tsy voadio ny ARN azontsika.Noho izany, ny cDNA aorian'ny transcription mivadika dia hifangaro amin'nygDNA.Tamin'ny fotoana ambanyqPCRfanehoan-kevitra,cDNAary ny gDNA dia azo ampitomboina miaraka, ka miteraka sanda CT somary kely, ka mety mitongilana ny valiny.
Inona àry no tokony hataontsika amin’izao toe-javatra izao?Foregenemanoro hevitra:
(1) Manaova fanadiovana genome amin'ny RNA mivadika, izay azo esorina amin'ny alàlan'ny fitrandrahana tsanganana mandritra ny fitrandrahana RNA;
(2) Karakarao amin'ny DNase ny ARN nalainaI , fa farano amin'ny EDTA;
ny reagents transcription mivadikamiaraka amin'ny modules fanadiovana génom;

Ahoana ny fisafidianana ny primer ho an'ny transcription mivadika?
Misy fiantraikany amin'ny vokatry ny fihetsiky ny transcription mivadika koa ny primers transcription.Azonao atao ny misafidy primer kisendrasendra, Oligo dT na primer manokana momba ny fototarazo ho an'ny fandikana mivadika araka ny toe-javatra manokana amin'ny fanandramana:
(1) Fandikan-teny manokana: Aroso ny primer manokana momba ny fototarazo;
(2) Taratasy sombitsombiny lava: Oligo dT/gene-specific primers no atolotra;
(3) Sombitsombiny anatiny amin'ny dika mitovy amin'ny fizarana lava: primer manokana fototarazo/ primer kisendrasendra / primer kisendrasendra + Oligo dT.Raha toa ka atao ny fanandramana qPCR manaraka, dia tsy azo ampiasaina irery ny Oligo dT, satria ny fampiasana Oligo dT irery dia mety miteraka fitongilanana farany amin'ny 3′, mitarika amin'ny valin'ny fanandramana qPCR tsy marina;
(4) miRNA: Azo ampiasaina ny primer-loop na ny tail primer.

Impiry impiry ny cDNA vokatra transcription mivadika no tokony ho levona mba hamaritana?
Aorian'ny fahazoana ny cDNA amin'ny vokatra transcription mivadika, impiry ny cDNA no tokony ho levona amin'ny fanandramana qPCR dia tena zava-dehibe.Raha avo loatra na ambany loatra ny fifantohana cDNA dia mety hisy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny amplification.Azo refesina ve ny fatran'ny cDNA, ary ahoana no tokony hatao?
(1) Tsy azo refesina ny fifantohan'ny cDNA amin'ny vokatra transcription mivadika, satria ankoatra ny vokatra cDNA, ny vokatra transcription mivadika koa dia misy Buffer sisa tavela amin'ny transcription, reverse transcriptase, primers, sns., izay hanelingelina ny valin'ny fandrefesana fifantohana ary miteraka OD260 / 280, OD260 / 280, OD260 / 230 tsy misy taratry ny tsy ara-dalàna.Amin'io fotoana io, hoy ny namana sasany, dia horefesiko ny fifantohana rehefa vita ny fanadiovana;eto, i Foregene dia mampahatsiahy fa ny cDNA dia tsy soso-kevitra ny hodiovina, satria ny halavan'ny cDNA azo amin'ny fiverenana dia tsy mitovy, ary ny cDNA fohy dia ho very amin'ny fanadiovana.
(2) Inona àry no hatao?Alohan'ny fanandramana qPCR dia azo faritana amin'ny alàlan'ny fanandramana mialoha ny dilution ny cDNA.Ohatra: ampiasao ny vahaolana stock cDNA, dilution 10-fold, ary dilution 100-fold ho modely amin'ny andrana qPCR, ary safidio ny fandotoana miaraka amin'ny sandan'ny CT eo amin'ny 18-28.

Ahoana no tokony handikana ny miRNA?
Ny miRNA dia RNA molekiola kely misy tady tokana manana haben'ny 22 nt eo ho eo izay tsy manisy code ho an'ny proteinina.Noho ny halavany fohy, ny fomba qPCR mahazatra dia sarotra ny manombatombana azy mivantana, noho izany dia ilaina ny manitatra ny miRNA;Ny fomba famadihana mifamadika matetika ho an'ny miRNA dia ahitana ny fomba amam-panao sy ny fomba tailing.
Ny fomba amam-panao dia ny fanitarana ny miRNA amin'ny alàlan'ny fampidirana ireo primer-loop.Ity fomba fitiliana ity dia manana fahatsapan-tena ambony kokoa sy manokana, saingy ambany ny fatran'ny fitiliana.Ny transcription mivadika iray dia tsy afaka mahita afa-tsy miRNA iray sy reference anatiny;Ny fomba fampidirana rambony dia ahitana roa. Vita amin'ny hetsika iraisan'ny anzima roa, dia ny PolyA polymerase sy ny reverse transcriptase.Ny polymerase PolyA dia tompon'andraikitra amin'ny fampidirana ny rambony PolyA amin'ny miRNA mba hampitombo ny halavany, ary ny transcriptase mivadika dia manao fanehoan-kevitra mivadika.Ity fomba ity dia manana fahaiza-mitarika avo lenta ary afaka mamantatra miRNA maro sy references anatiny ao anatin'ny transcription mivadika iray, saingy ambany ny fahatsapana sy ny spécialité amin'ny fomba fiasa stem-loop.