PCR, maro PCR, PCR in situ, Reverse PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Handamina ny foto-kevitra, ny dingana ary ny antsipiriany momba ny PCR isan-karazany izahay

Ⅰ. PCR

Polymerase Chain Reaction, antsoina hoe PCR, dia teknôlôjia biolojika molekiola izay ampiasaina hanitarana ny sombiny ADN manokana.Azo raisina ho toy ny replication ADN manokana in vitro izy io.Ny ADN polymerase (ADN Polymerase I) dia hita tany am-piandohan'ny taona 1955, ary ny Klenow Fragment of E. Coli, izay manana sanda ara-panandramana sy azo ampiharina, dia hitan'ny Dr. H. Klenow tany am-piandohan'ireo taona 1970, saingy noho io anzima io dia tsy mandefitra ny mari-pana, ny mari-pana ambony dia mety hanimba azy, noho izany dia tsy mahafeno ny fihetsiketsehan'ny rojo polymerase.Ny anzima ampiasaina ankehitriny (antsoina hoe Taq polymerase), dia natokana tamin’ny Thermus aquaticus, bakteria loharano mafana tamin’ny 1976. Ny mampiavaka azy dia ny mahatohitra ny mari-pana ambony sy ny anzima tsara indrindra, saingy be mpampiasa izy io taorian’ny taona 1980.Ny foto-kevitra tany am-boalohany momba ny prototype primitive voalohany amin'ny PCR dia mitovy amin'ny fanamboarana sy fanaovana kopia ny fototarazo, izay natolotry ny Dr. KJell Kleppe tamin'ny 1971. Namoaka ny kopian'ny fototarazo tsotra sy fohy voalohany izy (mitovy amin'ireo fanehoan-kevitra roa voalohany amin'ny PCR).Ny PCR novolavolaina androany dia novolavolain'i Dr. Kary B. Mullis tamin'ny 1983. Dr. Mullis dia nanompo orinasa PE tamin'io taona io, noho izany dia manana sata manokana ny PE ao amin'ny indostrian'ny PCR.Ny Dr. Mullis dia namoaka tamin'ny fomba ofisialy ny taratasy voalohany mifandraika amin'i Saiki sy ny hafa ao amin'ny 1985. Nanomboka teo, ny fampiasana PCR dia an'arivony kilaometatra isan'andro, ary ny kalitaon'ny taratasy mifandraika dia azo lazaina fa mahatonga ny fomba fikarohana maro hafa tsy hahafinaritra.Avy eo, ny teknolojia PCR dia ampiasaina betsaka amin'ny fikarohana siantifika biolojika sy ny fampiharana klinika, ka lasa teknolojia manan-danja indrindra amin'ny fikarohana biolojia molekiola.Nahazo ny loka Nobel momba ny simia koa i Mullis tamin'ny 1993.

PCRTORO LALAN'NY

Ny fitsipika fototra amin'ny teknolojia PCR dia mitovy amin'ny dingan'ny replication voajanahary amin'ny ADN, ary ny maha-tokana azy dia miankina amin'ny primer oligonucleotide izay mifameno amin'ny andaniny roa amin'ny filaharana kendrena.Ny PCR dia ahitana dingana telo amin'ny fanehoan-kevitra fototra telo: ①Fanimbana ny ADN môdely: Rehefa avy nafanaina teo amin'ny 93°C teo ho eo ny ADN môdely nandritra ny fe-potoana iray, dia ny vahaolana ADN roa ho an'ny ADN rojo roa noforonin'ny PCR fanamafisan'ny ADN môdely.②Ny fametahana (tambajotra) ny ADN môdely sy ny primer: Rehefa avy nafanaina ny ADN môdely ary nivadika ho rojo tokana, dia nidina ho 55°C eo ho eo ny mari-pana.Ny filaharana mifameno amin'ny primer sy ny rojo tokana ADN.③Ny fanitarana ny primer: ADN template-ny primer mamatotra dia mifototra amin'ny hetsika ny TaqDNA polymerase, miaraka amin'ny dNTP ho fanehoan-kevitra akora.Tazony ny fitsipiky ny replication, manambatra rojo kopia semi-reserved vaovao izay mameno ny rojo ADN môdely, ary mamerina ny dingana telo ny fanimbana-annealing-fanitarana ny dingana telo dia afaka mahazo "rojo kopia semi-reserved" bebe kokoa, ary ity rojo vaovao ity dia azo alaina indray ho lasa modely ho an'ny tsingerina manaraka.Mitaky 2-4min ny famitana ny tadivavarana, ny fototarazo kendrena dia azo ampitomboina im-betsaka ao anatin'ny 2-3 ora.

MalagasyPCRReaction System

Singa dimy amin'ny fihetsiky ny PCR

Misy karazana akora dimy indrindra tafiditra amin'ny fihetsiky ny PCR, dia ny primer, ny enzyme, ny dNTP, ny môdely ary ny buffer (Mg2+ no ilaina).[Procedure PCR]

Ny dingana PCR mahazatra dia mizara ho dingana telo

1. Fahasimban'ny ADN (90°C-96°C): Modely ADN misy rojo roa eo ambanin'ny hetsika mafana, tapaka ny fatoran'ny hydrogène, ka lasa ADN misy rojo tokana.

2. Fametahana (25 ℃ -65 ℃): Mihena ny mari-pana amin'ny rafitra, ny primer dia mitambatra amin'ny maodely ADN mba hamorona rojo roa eo an-toerana.

3. Fanitarana (70 ℃ -75 ℃): Eo ambanin'ny asan'ny Taq enzyme (manodidina ny 72 ° C, ny asa tsara indrindra), ny dNTP dia ampiasaina ho akora fototra, manomboka amin'ny faran'ny 5′ amin'ny faran'ny primer → 3′, ny synthesis sy ny môdely mifameno ny rojo ADN.

Ny tsingerina tsirairay dia denatured, annealed ary miitatra, mampitombo avo roa heny ny votoatin'ny ADN.Amin'izao fotoana izao, noho ny faritra fanamafisam-peo fohy, ny PCR sasany dia azo averina ao anatin'ny fotoana fohy na dia tsy tsara indrindra aza ny asan'ny enzyme Taq, ka azo ovaina amin'ny dingana roa izany, izany hoe ny fanalefahana sy ny fanitarana dia azo atao amin'ny 60 ° C-65 ° C amin'ny fotoana iray ihany.Mba hampihenana ny dingan'ny fampiakarana sy ny fampangatsiahana ary ny fanatsarana ny hafainganam-pandehan'ny valiny.

PCR Reaction endri-javatra

● High-Specific

Ny anton-javatra manapa-kevitra manokana amin'ny valin'ny PCR dia: ①Ny fampifangaroana manokana ny primer sy ny ADN môdely.②Ny fitsipiky ny fampiraisana fototra.③Ny tsy fivadihan'ny TaqDNA polymerase synthesis fanehoan-kevitra.④ Ny maha-tokana sy ny conservative ny fototarazo kendrena.

Ny fampifangaroana marina amin'ny primers sy ny template no fanalahidy.Ny famatorana ny primer sy ny môdely ary ny fanitarana ny rojo voalohany dia mifototra amin'ny fitsipiky ny fifanandrinana fototra alkaline.Ny tsy fivadihan'ny fanehoan-kevitra synthesis polymerase sy ny fanoherana ny hafanana ambony amin'ny polymerase ADN Taq mba hahatonga ny famatorana (tambajotra) ny môdely sy ny primer amin'ny fanehoan-kevitra dia azo atao amin'ny hafanana ambony kokoa.Nitombo be ny maha-tokana ny fitambarana.Ny clip dia afaka mitazona mari-pahaizana ambony.Amin'ny fisafidianana faritra fototarazo kendrena manana conservative avo lenta sy conservative avo lenta, avo kokoa ny maha-tokana azy.

● Fihetseham-po ambony

Ny habetsaky ny famokarana vokatra PCR dia ampitomboina amin'ny fanondroana, izay afaka manitatra ny modely fanombohana an'ny Picker (PG=10-12) mba hampitombo ny haavon'ny microcontroller amin'ny haavon'ny micrograms (μg= -6).Ny sela kendrena dia azo tsikaritra avy amin'ny sela 1 tapitrisa;amin'ny fitadiavana virosy, ny fahatsapan'ny PCR dia mety hahatratra 3 RFUs (toerana tsy misy dikany)Ny tahan'ny fitiliana kely indrindra amin'ny siansa bakteria dia bakteria 3.

● Tsotra sy haingana

Ny fandinihan'ny PCR dia mampiasa polymerase Taq ADN amin'ny hafanana avo, izay manampy ny vahaolana amin'ny fotoana iray, izany hoe, fanehoan-kevitra fanindroany-anneal-extension amin'ny vahaolana fanamafisana ADN sy vilany fandroana rano.Amin'ny ankapobeny dia vita ao anatin'ny 2 ka hatramin'ny 4 ora ny fanehoan-kevitra fanamafisam-peo.Ny vokatra ampitomboina amin'ny ankapobeny dia dinihina amin'ny alàlan'ny sabatra elektrika, ary tsy mila mampiasa isotopes, tsy misy fandotoana radioaktifa, ary fampiroboroboana mora.

● Kely ny fahadiovan’ny santionany

Tsy ilaina ny manasaraka viriosy na bakteria sy sela kolontsaina.Ny vokatra vita amin'ny ADN sy ny ARN dia azo ampiasaina ho fanamafisam-peo.Ny fitiliana fanamafisam-peo ADN dia azo ampiasaina mivantana amin'ny fampiasana santionany klinika toy ny ra, ranon-tena, ranon-kohaka, volo, sela ary sela velona.

PCRolana mahazatra

● False négatif, tsy misy tady amplifier

Ny dingana manan-danja amin'ny fihetsiky ny PCR dia ahitana: ① fanomanana ny asidra nukleika môdely, ② ny kalitao sy ny maha-tokana ny primers, ③ ny kalitaon'ny enzymes ④ ny toetry ny tsingerin'ny PCR.Ny fitadiavana ny antony dia tokony hodinihina sy hianarana ihany koa ho an'ireo rohy etsy ambony.

Modely: ① Ny môdely dia misy proteinina isan-karazany, ② Ny môdely dia misy Taq enzyme inhibitor, ③ Ny proteinina ao amin ny môdely dia tsy esorina, indrindra ny proteinina vondrona ao amin ny krômôzôma.⑤ Ny fahasimban'ny asidra nukleika deminer dia tsy feno.Rehefa tsara ny kalitaon'ny enzymes sy ny primers dia tsy misy tarika amplification, izay azo inoana fa ny fitsaboana ny fandevonan-kanina ny santionany.Misy zavatra tsy mety amin'ny dingan'ny fitrandrahana asidra nucleic template, ka mba hanomanana vahaolana mahomby sy maharitra amin'ny fandevonan-kanina dia tokony ho raikitra ny fomba fiasany ary tsy ovaina amin'ny fomba tsy ara-dalàna.

Enzyme inactivation: Enzyme vaovao na anzima taloha sy vaovao dia tokony hampiasaina miaraka mba handinihana raha very na tsy ampy ny asan'ny enzyme, izay mitarika ho amin'ny ratsy diso.Tsara homarihina fa ny Taq enzyme na ethidium bromide dia adino indraindray.

Primer: ny kalitaon'ny primer, ny fifantohana amin'ny primer, ary ny fifantohana amin'ireo primer roa dia symmetrical.Antony mahazatra ny tsy fahombiazan'ny PCR na ny tarika mitombo dia tsy mety ary mora miparitaka.Misy olana amin'ny kalitaon'ny laharana voalohany amin'ny isa maromaro.Ny primers roa dia manana fifantohana avo sy ambany, ka miteraka asymmetric amplification ambany.Ny fanoherana dia: ① Mifidiana primer tsara hanambatra singa.② Ny fifantohana amin'ny primer dia tsy miankina amin'ny sandan'ny OD ihany, fa koa mifantoka amin'ny ranon-tsavony tany am-boalohany mba hanaovana electrophoresis gel sugar agar.Tsy maintsy misy faritra fanala voalohany, ary tokony hifanaraka amin'ny ankapobeny ny famirapiratan'ireo primer roa.Belt, PCR dia mety tsy hahomby amin'izao fotoana izao, ary tokony hovahana amin'ny unit synthesis primer.Raha avo lenta ny primer iray, dia ambany ny famirapiratana, ary tsy maintsy mifandanja ny fifantohana azy rehefa arotsaka.③ Ny voalohany dia tokony aloa sy tehirizina amin'ny fifantohana avo mba hisorohana ny fampangatsiahana maro na maharitra maharitra faritra vata fampangatsiahana, izay hahatonga ny primer hiharatsy sy hiharatsy.④ Ny famolavolana ny primer dia tsy mitombina, toy ny halavan'ny primer dia tsy ampy, ary ny di cluster dia miforona eo anelanelan'ny primers.

Mg2+concentration: Mg2+ion concentration dia misy fiantraikany lehibe amin'ny fahombiazan'ny amplification PCR.Ny fifantohana tafahoatra dia mety hampihena ny firaisana ara-nofo amin'ny fanamafisana ny PCR.Raha ambany loatra ny fifantohana, ny famoahana PCR amplification dia hahatonga ny tsy fahombiazan'ny amplification PCR raha tsy misy ny tarika fanitarana.

Fanovana ny habetsaky ny fanehoan-kevitra: Ny boky ampiasaina amin'ny fanamafisam-peo PCR dia 20ul, 30ul, ary 50ul na 100uL, ny habetsaky ny fampiharana amin'ny fanamafisana PCR dia napetraka araka ny tanjona samihafa amin'ny fikarohana siantifika sy ny fitsapana klinika.Aorian'ny fanaovana boky kely toy ny 20ul dia ilaina ny manao fepetra tady rehefa manao ny habeny, raha tsy izany dia tsy hahomby.

Antony ara-batana: Tena zava-dehibe ny fanovana ny PCR amplification.Raha ambany ny mari-pana degeneration, fohy ny fotoana faharavana, mety hitranga amin'ny ratsy diso izany;ambany loatra ny mari-pana annealing dia mety hiteraka fanamafisam-peo tsy voafaritra ary hampihena ny fahombiazan'ny fanamafisana manokana.Tena misy fiantraikany amin'ny fitambaran'ny primer sy ny maodely hampihenana ny fahombiazan'ny amplification PCR.Indraindray dia ilaina ny mampiasa fitsipika thermometer mba hamantarana ny fiovaovan'ny, annealing sy nitarina mari-pana ao amin'ny fanitarana na ny rano - levona cooker, izay iray amin'ireo antony ny tsy fahombiazan'ny PCR.

Varian'ny filaharan'ny kendrena: Raha mitranga ny filaharana kendrena, dia misy fiovana na famafana, atambatra ny fitambaran'ny prototype sy ny môdely, na noho ny tsy fisian'ny filaharana kendrena, dia ho very ny filaharana mifameno ny primer sy ny môdely, ary tsy hahomby ny fanamafisan'ny PCR azy.

● Fanehoan-kevitra diso

Ny tarika fanamafisam-peo PCR dia toa mifanaraka amin'ny tarika filaharana kendrena, ary indraindray ny tarika dia milamina kokoa sy ambony kokoa.

Ny famolavolana voalohany dia tsy mety: ny filaharan'ny amplification voafantina sy ny filaharan'ny amplification tsy misy tanjona dia manana homologous, ka rehefa amplification PCR, ny vokatra PCR amplified dia tsy misy tanjona.Fohy loatra ny filaharan'ny kendrena na fohy loatra ny primer, ary mety ho diso positive.Mila havaozina.

Fandotoana mifanandrify amin'ny filaharana kendrena na vokatra fanamafisam-peo: Misy antony roa mahatonga an'io loto io: Voalohany, fandotoana ny fototarazo manontolo na ampahany lehibe, mitarika ho amin'ny fahatsarana diso.Ity karazana fanendrikendrehana diso ity dia azo vahana amin'ny alalan'ireto fomba manaraka ireto: Mitandrema sy malefaka mandritra ny fandidiana mba hisorohana ny filaharan'ny kendrena tsy hiditra ao anatin'ny basy santionany na hivoaka avy ao amin'ny fantsona centrifugal.Afa-tsy ireo enzymes sy akora tsy mahatanty ny mari-pana ambony, ny reagents na fitaovana rehetra dia tokony hodiovina amin'ny tsindry avo.Ny fantsona centrifugal sy ny santionany dia tokony hampiasaina indray mandeha.Raha ilaina, alohan'ny hampidirana santionany, ny fantsona fanehoan-kevitra sy ny reagent dia mibaribary amin'ny taratra ultraviolet mba handrava ny asidra nokleika efa misy.Faharoa, sombiny kely amin'ny fahalotoan'ny rivotra.Ireo sombintsombiny kely ireo dia fohy kokoa noho ny filaharana kendrena, saingy manana homolojia sasantsasany.Afaka mifamatotra izy io.Aorian'ny famenoana ireo primers dia azo itarina ny vokatra PCR, izay hiteraka famokarana tsara diso.Azo ampiasaina hampihenana na hanafoanana ny fomba PCR akany.

● Miseho tarika fanamafisam-peo tsy voafaritra

Ireo tarika izay niseho taorian'ny fanamafisan'ny PCR dia tsy mifanaraka amin'ny habeny andrasana, na lehibe na kely, na miaraka amin'ny fotoana iray, na amin'ny fotoana iray ihany, ny tarika amplification manokana sy ny tarika amplification tsy voafaritra.Ny fipoiran'ny tarika tsy voafaritra dia: Voalohany, ny primer dia tsy feno famenon'ny filaharana kendrena, na ny polymerization ny primer mba hamorona di cluster.Ny faharoa dia ny fatran'ny MG2 + ions dia avo loatra, ny mari-pana fanalana dia ambany loatra, ary ny isan'ny tsingerin'ny PCR dia mifandray.Faharoa, ny kalitao sy ny habetsahan'ny enzymes.Matetika, ny anzima avy amin'ny loharano sasany dia mora amin'ny tarika tsy manokana ary tsy mitranga ny anzima avy amin'ny loharano hafa.Indraindray dia misy ihany koa ny fanamafisana ny enzymes tsy voafaritra.Ny fanoherana dia: amboarina tsara tarehy raha ilaina.Ahena ny habetsahan'ny anzima na soloy ny anzima avy amin'ny loharano hafa.Ahena ny isan'ny voalohany, ampitomboy araka ny tokony ho izy ny isan'ny môdely, ary ahena ny isan'ny tsingerina.Ampitomboy araka ny tokony ho izy ny mari-pana fanalefahana na ampiasao ny fomba roa amin'ny mari-pana (93°C ny fahapotehana, ny fanalana ary ny fanitarana eo amin'ny 65°C eo ho eo).

● Asehoy ny kasety mitsoka na manosotra

Ny fanamafisam-peo PCR indraindray dia toa ampiharina na fehikibo toy ny karipetra.Noho ny antony, noho ny habetsahan'ny anzima be loatra na ny tsy fahampian'ny kalitaon'ny enzyme, ny dNTP dia avo loatra, ny Mg2 + dia avo loatra, ny mari-pana annealing dia ambany loatra, ary ny isan'ny tsingerina dia be loatra.Ny fanoherana dia: ①Ahena ny habetsahan'ny enzymes, na ovay ny enzyme amin'ny loharano hafa.②Ahena ny fifantohana amin'ny dNTP ③Ahena araka ny tokony ho izy ny fifantohana Mg2+.④Ampitomboy ny isan'ny môdely ary ahena ny isan'ny tsingerina.

Vokatra mifandraika

PCR Heroᵀᴹ (miaraka amin'ny loko)

◮ Fahatokiana ambony kokoa: avo 6 heny noho ny an'ny enzyme Taq mahazatra;

◮ Haingam-pandeha haingana kokoa

◮ Mora kokoa ny mampifanaraka ny maodely

◮ Fahombiazana kokoa amin'ny fanamafisam-peo

◮ Mahery kokoa ny fandeferana amin'ny tontolo iainana: apetraka amin'ny 37°C mandritra ny herinandro, mitazona hetsika mihoatra ny 90%;

◮ Manana hetsika polymerase ADN 5'→3' izy ary hetsika exonuclease 5'→3', tsy misy hetsika exonuclease 3'→5'.

PCR Easyᵀᴹ (miaraka amin'ny loko)

Ny rafitra fanehoan-kevitra tsy manam-paharoa sy ny Taq DNA Polymerase avo lenta dia mahatonga ny fanehoan-kevitry ny PCR hanana fahombiazana ambony kokoa, manokana ary fahatsapana.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Iray dingana)-SYBR Green I

◮ Kit iray dingana dia manao transcription mivadika ary qPCR fanehoan-kevitra roa ao anaty fantsona iray ihany, mila ampiana RNA môdely, primer PCR manokana ary RNase-Free ddH₂O.

◮ Ny kitapo dia afaka mamakafaka haingana sy mahomby amin'ny fatran'ny viriosy RNA na trace RNA.

◮ Ny kitapo dia mampiasa reagent foregene reverse transcription tsy manam-paharoa sy Foregene HotStar Taq DNA Polymerase miaraka amina rafitra fanehoan-kevitra tokana mba hanatsarana ny fahombiazan'ny amplification sy ny maha manokana ny fanehoan-kevitra.

◮ Ny rafitra fanehoan-kevitra optimized dia mahatonga ny fanehoan-kevitra ho mora kokoa amin'ny fahitana, ny fahamarinan-toerana mafana kokoa ary ny fandeferana tsara kokoa.

◮ RT-qPCR Mora^TM(Dingana iray) -Ny kitapo SYBR Green I dia miaraka amin'ny loko fanondro anatiny ROX, izay azo ampiasaina hanesorana ny fiaviana famantarana sy ny lesoka famantarana eo anelanelan'ny lavadrano, izay mety ho an'ny mpanjifa ampiasaina amin'ny maodely samihafa amin'ny fitaovana PCR.

RT mora^TMII (Master Premix ho an'ny synthesis cDNA voalohany ho an'nyPCR tena izy)

- Fahaizana mahomby manala ny gDNA, izay afaka manala ny gDNA ao amin'ny môdely ao anatin'ny 2 minitra.

-Rafitra transcription mivadika mahomby, 15 minitra monja no hamitana ny synthesis ny cDNA tady voalohany.

-Modely saro-takarina: ireo maodely manana votoaty GC avo lenta sy rafitra faharoa sarotra dia azo averina amin'ny fahombiazana avo.

-Rafitra transcription mivadika avo lenta, ny maodely pg-level dia afaka mahazo cDNA avo lenta ihany koa.

-Ny rafitra transcription mivadika dia manana fahamarinan-toerana mafana avo lenta, ny mari-pana fanehoan-kevitra tsara indrindra dia 42 ℃, ary mbola manana fampisehoana transcription tsara amin'ny 50 ℃.