Ny spécific de detection
Amin'ny ankabeazan'ny toe-javatra, ny tanjon'ny famolavolana primer dia ny hanamafisana ny maha-tokana ny PCR.Izany dia voafaritra amin'ny fitaoman'ny vinavina maro kokoa na latsaka.Ny fiovana lehibe iray dia ny filaharana amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer.
Ny tena zava-dehibe, ny fitiliana PCR natao ho an'ny spécialité dia azo inoana fa hihazona fahombiazana ambony amin'ny sehatra midadasika midadasika, satria ny assay dia tsy mamokatra vokatra fanamafisam-peo tsy voafaritra, ka mifaninana amin'ny reagents PCR na manakana ny fanehoan-kevitra lehibe indrindra.
Mazava ho azy, amin'ny toe-javatra sasany, ny specificity dia tsy ny zava-dehibe indrindra, ohatra, raha ny tanjona dia ny hamantatra ny fifandraisana akaiky fa samy hafa pathogens, famolavolana manokana, optimization sy ny fanamarinana fenitra takiana.
Ny curve mitsonika dia fomba mahazatra amin'ny fanombanana ny maha-tokana ny amplicons, farafaharatsiny amin'ny resaka na hanamafisana tanjona tokana.Na izany aza, tokony hohamafisina fa mety hamitaka ny curve miempotra satria, ohatra, dia mety hisy fiantraikany amin'ny vokatry ny fitambaran'ny primers suboptimal sy ny fifantohana modely ambany.
P5 |Ny curve fandoroana dia mampiseho ny fiovan'ny Tm azo avy amin'ny fahitana roa amin'ny habetsahan'ny ADN roa kendrena.
A. Amin'ny fifantohana avo kokoa (ad)), dia tsy misy dimer primer mazava tsara rehefa vita ny fandrefesana qPCR.Rehefa mihena hatramin'ny 50 kopia (e) ny fifantohan'ny môdely, dia manomboka miseho ny vokatra tsy voafaritra ary lasa vokatra tokana amin'ny fifantohana ambany indrindra (f).
B. Ny fitsapana dia nandrakitra Tms mitovy amin'ny fifantohana rehetra kendrena, ary tsy nisy dimer primer mazava tsara na dia tamin'ny fifantohana ambany indrindra aza (5 dika).Rehefa mampiasa ireo fomba fisavana roa ireo dia tsy nisy vokatra fanamafisam-peo hita tao amin'ny NTC.
Ny P5 dia mampiseho ny curve fandravana azo amin'ny santionany izay misy ny môdely amin'ny fifantohana samihafa.P 5a dia mampiseho fa amin'ny fifantohana roa ambany indrindra, ny Tms amin'ny vokatra fanamafisana tsy voafaritra dia ambany noho ny an'ny amplicons manokana.
Mazava ho azy fa tsy azo ampiasaina amin'ny fomba azo antoka io fomba fitiliana io mba hamantarana ireo lasibatra misy amin'ny fifantohana ambany.
Mahaliana fa ny NTCs, izany hoe, santionany tsy misy ADN mihitsy, dia tsy nandrakitra vokatra fanamafisam-peo (tsy voafaritra), izay manondro fa ny ADN génomika afara dia afaka mandray anjara amin'ny fanamafisana / polymerization tsy voafaritra.
Indraindray dia tsy azo amboarina ny primer fototra toy izany sy ny fanamafisam-peo tsy voafaritra, fa matetika azo atao ny mamolavola fomba fitiliana izay tsy misy fanamafisam-peo tsy voafaritra amin'ny fifantohana modely sy NTC (P 5b).
Eto, na dia ny firaketana ny fanamafisana ny fifantohana kendrena amin'ny Cq amin'ny 35 aza dia hamokatra curve famongorana manokana.Toy izany koa, ny NTC dia tsy naneho famantarana ny fanamafisam-peo tsy voafaritra.Indraindray, mety miankina amin'ny toaka reny ny fitondran-tenan'ny fitiliana, ary ny fanamafisana tsy voafaritra ihany no hita amin'ny fitambarana buffer sasany, izay mety mifandray amin'ny fifantohana Mg2+ samihafa.
Fahamarinan'ny fitiliana
Ny fanatsarana ny Ta dia dingana mahasoa amin'ny fanamarinana empirical sy ny fizotry ny fanatsarana ny fitadiavana qPCR.Izy io dia manome famantarana mivantana ny hamafin'ny primer napetraka amin'ny alalan'ny fampisehoana ny mari-pana (na ny mari-pana) izay mamokatra ny ambany indrindra Cq tsy manamafy ny NTC.
Ny fahasamihafan'ny fahasamihafan'ny roa ka hatramin'ny efatra heny amin'ny fahatsapana dia mety tsy ho zava-dehibe ho an'ny olona manana fanehoana mRNA avo lenta, fa ho an'ny fitsapana diagnostika, dia mety midika izany ny fahasamihafana misy eo amin'ny vokatra tsara sy diso.
Ny toetran'ny Ta amin'ny primer qPCR dia mety miovaova be.Ny fitsapana sasany dia tsy dia matanjaka loatra, ary raha tsy atao eo ambanin'ny sanda Ta tsara indrindra amin'ny primers izy ireo, dia hirodana haingana izy ireo.
Zava-dehibe izany satria matetika misy olana eo amin'ny tontolo tena izy io karazana fitiliana io, ary mety tsy ho tsara indrindra ny fahadiovan'ny santionany, ny fifantohan'ny ADN, na ny fisian'ny ADN hafa.
Ankoatr'izay, ny laharan'ny kopia kendrena dia mety tsy mitovy amin'ny isan-karazany, ary ny reagents, ny fitaovana plastika, na ny fitaovana dia mety tsy mitovy amin'ireo ampiasaina amin'ny fametrahana ny fitsapana.
P6|Ny gradient mari-pana dia mampiseho ny hamafin'ny PCR detection isan-karazany.
A. Mampiasà mastermix Sensifast SYBR an'ny Bioline (laharan'ny katalaogy BIO-98050) hanaovana PCR amin'ny cDNA nomanina avy amin'ny RNA atidohan'olombelona.
B. Ampiasao ny zavamaneno CFX qPCR an'ny Bio-Rad mba hanoratana ny sarintany fanamafisam-peo sy ny fiolahana fanafoanana ny apalene (NM_033207, F: GCCATGGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Grapika fanamafisam-peo sy curve mitsonika ny ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Grapika fanamafisam-peo sy curve fandravana ny GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs voarakitra amin'ny hafanan'ny annealing samy hafa, mampiseho ny fahasamihafana ao amin'ny Cq voarakitra ao ambanin'ny 7C mari-pana gradient.
Ny P 6 dia mampiseho vokatra mahazatra amin'ny fitsapana tsy ilaina, izay nanaovana ny qPCR tamin'ny fampiasana gradient Tas eo anelanelan'ny 59C sy 67C (P 6a), amin'ny fampiasana primer ho an'ny fototarazo manokana telo amin'ny atidoha.
Hita avy amin'ny kisary fanamafisam-peo fa lavitry ny idealy ny primers Opalin satria tery be ny fari-piainan'ny Ta tsara indrindra (sary 6b), izany hoe miparitaka be ny Cqs, ka mampitaha ny Cqs amin'ny Cqs Low tsara indrindra.
Ity fomba fizahana ity dia tsy miorina ary mety hitarika amin'ny fanamafisam-peo ambany indrindra.Noho izany, tokony hamboarina indray ireo primer roa ireo.Fanampin'izany, ny famakafakana curve miempotra (inset) dia mampiseho fa mety ho olana ihany koa ny spécialité an'ity fomba fitiliana ity, satria tsy mitovy ny curve mitsonika ny Ta tsirairay.
Ny fomba fitiliana ACSBG1 aseho ao amin'ny P 6c dia matanjaka kokoa noho ny fomba fitiliana Opalin etsy ambony, saingy mbola lavitra ny idealy, ary azo inoana fa azo hatsaraina.
Na izany aza, manantitrantitra izahay fa tsy misy fifandraisana ilaina eo amin'ny fahamendrehana sy ny maha-tokana, satria ny curve famongorana novokarin'ity fomba fitiliana ity dia mampiseho ny sanda ambony indrindra amin'ny Tas rehetra (inset).
Amin'ny lafiny iray, ny fitsapana matanjaka dia mandefitra kokoa, mamokatra Cq mitovy amin'ny Tas isan-karazany, toy ny amin'ny fitsapana GFAP aseho ao amin'ny P 6d.
Ny fahasamihafan'ny Cqs azo amin'ny elanelana 8 degre Celsius mitovy dia latsaky ny 1, ary ny curve famongorana (inset) dia manamafy ny toetran'ny fitiliana amin'ity mari-pana ity.Tsara ny manamarika fa mety tsy hitovy mihitsy ny Tas kajy sy ny tena Ta.
Misy torolalana maro natao hanampiana ny mpikaroka hamolavola primer mahomby, ny ankamaroany dia mifototra amin'ny fitsipika efa hatry ny ela ary be dia be ny fiheverana ny 3′end amin'ny primers.Matetika dia soso-kevitra ny hampiditra G na C amin'ny faran'ny 3' ary roa G na C fototra (GC clamp), fa tsy mihoatra ny roa amin'ny farany 5 fototra.
Amin'ny fampiharana, ireo fitsipika ireo dia afaka mitarika ny mpikaroka, saingy tsy voatery ho marina izy ireo amin'ny toe-javatra rehetra.
P7 |Ny fiafaran'ny 3′ amin'ny primer dia misy fiantraikany kely amin'ny fahamendrehana na ny fahombiazany.
A. Ny toerana misy ny primer ho an'ny olombelona HIF-1α (NM_181054.2).
B. Mampiasà Agilent Brilliant III SYBR Green-reny toaka (Cat. No. 600882) mba hanamafisana ireo zavatra andrana enina.
C. Saripika fanamafisam-peo sy curve mitsonika noraketin'ny zavamaneno CFX qPCR an'ny Bio-Rad sy primer 3′end.Ny NTC dia aseho amin'ny loko mena.
D. Cqs firaketana ny zavatra fitsapana tsirairay
Ohatra, ny vokatra ao amin'ny P 7 dia mifanohitra amin'ny fitsipika 3′end.Ny endrika rehetra dia mamokatra vokatra mitovy amin'ny ankapobeny, miaraka amin'ny fitambarana voalohany roa ihany no mitondra mankany amin'ny fanamafisana tsy voafaritra ao amin'ny NTC.
Na izany aza, tsy afaka manohana ny fiantraikan'ny clip GC izahay, satria amin'ity tranga ity, ny fampiasana A na T ho fototra 30 ambony indrindra dia tsy mampihena ny fahamendrehana.
Fitsapana C, izay niafaran'ny F primer ao amin'ny GGCC, dia nandrakitra Cqs ao amin'ny NTCs, izay manondro fa mety te-hiala ireo filaharana ireo amin'ny faran'ny 30.Antitranterinay fa ny hany fomba hamaritana ny filaharan'ny 3′end tsara indrindra amin'ny mpivady voalohany dia ny fanombanana ireo kandida voalohany amin'ny andrana.
Fahombiazan'ny amplification
Ny tena zava-dehibe, na dia tsy mety ho voafaritra manokana aza ny fitiliana PCR tsy voafaritra, dia azo amboarina sy ampitomboina amin'ny fomba maro ny fahombiazan'ny amplification amin'ny alàlan'ny fanovana ny enzyme, ny toaka reny, ny additives ary ny toetry ny bisikileta.
Mba hanombanana ny fahombiazan'ny fitiliana PCR, dia tsara ny mampiasa dilution serial 10 na in-5 ny asidra nokleika kendrena, izany hoe ny "fomba curve manara-penitra".
Raha amplicons PCR na lasibatra ADN synthetic no ampiasaina mba hamoronana curve mahazatra, ny dilution serial an'ireo tanjona ireo dia tokony hifangaro amin'ny ADN tsy miova (toy ny ADN génomika).
P8 |Curve dilution hanombanana ny fahombiazan'ny PCR.
A. Mampiasà primer ho an'ny HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ary R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC sy Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalaogy laharana 600882) ho an'ny PCR sy ny toetry ny curve mitsonika.
B. 100 ng RNA dia naverina nadika, nopotehina in-2, ary ny santionan'ny cDNA natsofoka dia nalevina in-5 ka hatramin'ny ADN génomika olombelona 1 ng.Ny curve mitsonika dia aseho eo amin'ny sisiny.
C. Ny fanehoan-kevitry ny RT, ny dilution ary ny dilution serial dia naverina ho an'ny santionan'ny cDNA faharoa, ary nitovitovy ny valiny.
Ny P 8 dia mampiseho curve mahazatra roa, mampiasa fomba fitiliana mitovy amin'ny santionan'ny cDNA roa samy hafa, ny vokatra dia mitovy amin'ny fahombiazany, eo amin'ny 100%, ary ny sanda R2 dia mitovy ihany koa, izany hoe ny mari-pahaizana mifanaraka amin'ny angon-drakitra andrana sy ny tsipika regression na ny angon-drakitra Degree of linearity.
Ireo curve mahazatra roa dia azo ampitahaina, saingy tsy mitovy.Raha ny tanjona dia ny hamantatra tsara ny tanjona, dia tokony ho marihina fa tsy azo ekena ny manome kopia isa kajy raha tsy manazava ny tsy fahazoana antoka
P9 |Fandrefesana tsy azo antoka mifandray amin'ny quantification mampiasa curve mahazatra.
A. Mampiasà primer ho an'ny GAPDH (NM_002046) mba hanatanterahana ny PCR sy ny toetry ny curve mitsonika.F: ACAGTTGCCATGTAGACC sy R: TAACTGGTTGAGCACAGG ary ny mastermix Sensifast SYBR an'ny Bioline (katalaogy BIO-98050).
B. Sarimihetsika fanamafisam-peo, curve mitsonika ary curve mahazatra voarakitra miaraka amin'ny fitaovana CFX qPCR an'ny Bio-Rad.
C. Sarimihetsika curve manara-penitra sy elanelana fahatokisana 95% (CI).
D. Ny laharan'ny kopia sy ny elanelan'ny fahatokisana 95% amin'ireo soatoavina Cq telo azo avy amin'ny curve dilution.
Ny P 9 dia mampiseho fa ho an'ny fitsapana optimized, ny fiovaovan'ny toetran'ny curve manara-penitra tokana dia eo amin'ny in-2 (95% ny elanelan'ny fahatokisana, ny kely indrindra hatramin'ny ambony indrindra), izay mety ho fiovaovana kely indrindra azo antenaina.
Vokatra mifandraika:
Fotoana fandefasana: Sep-30-2021
