RT-qPCR dia novolavolaina tamin'ny teknolojia PCR mahazatra.Manampy simika fluorescent (fandokoana fluorescent na probe fluorescent) amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR nentim-paharazana, ary mahita ny fizotran'ny PCR annealing sy fanitarana amin'ny fotoana tena izy araka ny mekanika luminescent samihafa.Ny fiovan'ny mari-pamantarana fluorescent ao amin'ny medium dia ampiasaina hanombanana ny habetsaky ny fiovan'ny vokatra isaky ny tsingerin'ny PCR.Amin'izao fotoana izao, ny fomba mahazatra indrindra dia ny fomba fandokoana fluorescent sy ny fomba fanadihadiana.

fomba fandokoana fluorescent:
Ny lokon'ny fluorescent sasany, toy ny SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, sns., dia tsy mamoaka hazavana ho azy, fa mamoaka fluorescence rehefa mifamatotra amin'ny lavaka kely amin'ny dsDNA.Noho izany, amin'ny fiandohan'ny fanehoan-kevitra PCR, ny milina dia tsy afaka mahita ny famantarana fluorescent.Rehefa mizotra mankany amin'ny fanitarana annealing (fomba dingana roa) na dingana fanitarana (fomba dingana telo) ny fanehoan-kevitra, dia misokatra amin'izao fotoana izao ny tady roa, ary ny polymerase ADN vaovao Mandritra ny synthesis strand, ny molekiola fluorescent dia mitambatra ao amin'ny lavaka kely dsDNA ary mamoaka fluorescence.Rehefa mitombo ny isan'ny tsingerin'ny PCR, dia mihamaro ny loko mitambatra amin'ny dsDNA, ary mihamitombo hatrany koa ny famantarana fluorescent.Raiso ho ohatra ny SYBR Green Ⅰ.
Fomba fikarohana:
Taqman probe no probe hydrolysis matetika ampiasaina.Misy vondrona fluorescent amin'ny faran'ny 5′ amin'ny probe, matetika FAM.Ny probe mihitsy dia filaharana mifameno amin'ny fototarazo kendrena.Misy vondrona famonoana fluorescent amin'ny faran'ny 3′ amin'ny fluorophore.Araka ny fitsipiky ny fifindran'ny angovo fluorescence resonance (Förster resonance angovo famindrana, FRET), rehefa ny mpanao gazety fluorescent vondrona (mpanome fluorescent molekiola) sy ny famonoana fluorescent vondrona (acceptor fluorescent molekiola) Rehefa ny excitation spectrum mifanindry ary ny halavirana dia tena akaiky (7-10nm), ny fientanam-po ny molekiola fluorescent malemy dia afaka manaiky ny molekiola fluorescence. ned.Noho izany, amin'ny fiandohan'ny fanehoan-kevitra PCR, rehefa malalaka sy tsy misy dikany ny probe ao amin'ny rafitra, ny vondrona fluorescent mpanao gazety dia tsy hamoaka fluorescence.Rehefa manao annealing, ny primer sy ny probe dia mifatotra amin'ny môdely.Mandritra ny dingana fanitarana, ny polymerase dia mamorona rojo vaovao tsy tapaka.Ny ADN polymerase dia manana hetsika exonuclease 5′-3′.Rehefa tonga any amin'ny probe, ny polymerase ADN dia hi-hydrolyze ny probe avy amin'ny môdely, hanasaraka ny vondrona fluorescent mpanao gazety amin'ny vondrona fluorescent quencher, ary hamoaka ny famantarana fluorescent.Koa satria misy fifandraisana tokana eo amin'ny probe sy ny môdely, ny fomba probe dia ambony noho ny fomba fandokoana raha ny marina sy ny fahatsapana ny fitsapana.

Fig 1 Fitsipiky ny qRT-PCR

Famolavolana voalohany
Fitsipika:

Ny primers dia tokony hamboarina ao amin'ny faritra voatahiry ao amin'ny andiana asidra nukleika ary manana ny maha-tokana azy.

Tsara kokoa ny mampiasa filaharan'ny cDNA, ary azo ekena koa ny filaharana mRNA.Raha tsy izany dia fantaro ny famolavolana faritra cd amin'ny filaharan'ny ADN.
Ny halavan'ny vokatra fluorescent quantitative dia 80-150bp, ny lava indrindra dia 300bp, ny halavan'ny primer amin'ny ankapobeny dia eo anelanelan'ny 17-25 fototra, ary tsy tokony ho lehibe loatra ny fahasamihafana misy eo amin'ny ambaratonga ambony sy ambany.

Ny votoatin'ny G+C dia eo anelanelan'ny 40% sy 60%, ary 45-55% no tsara indrindra.
Ny sandan'ny TM dia eo anelanelan'ny 58-62 degre.
Miezaha hialana amin'ny dimer primer sy self-dimer, (tsy miseho mihoatra ny 4 tsiroaroa amin'ny fototra mifameno mifanesy) firafitry ny hairpin, raha tsy azo ihodivirana, ataovy ΔG<4.5kJ/mol* Raha tsy azonao antoka fa nesorina ny gDNA nandritra ny fandikana mivadika Madio, dia tsara indrindra ny manamboatra ny primer amin'ny intron * 3′ faritra tsy azo ovaina, tsy azo ovaina ny faritra AT, G/GC, ary tsy azo ovaina ny faritra A/GC. ) primers sy tsy
manokana Ny homôlôjia amin'ny filaharana heterogène mihamatanjaka dia tsara kokoa raha latsaky ny 70% na manana homôlôjia fototra 8 mifameno.
angona:
CottonFGD fikarohana amin'ny teny fanalahidy
Famolavolana voalohany:
IDT-qPCR famolavolana primer

Fig2 IDT pejin'ny fitaovana famolavolana primer an-tserasera

Fig3 vokatra pejy fampisehoana
Famolavolana ny lncRNA primers:
lncRNA:dingana mitovy amin'ny mRNA.
miRNA:Ny fitsipiky ny fomba fametahana tady: Satria ny miRNA rehetra dia filaharana fohy eo amin'ny 23 nt eo ho eo, tsy azo atao ny fitiliana PCR mivantana, noho izany dia ampiasaina ny fitaovana filaharan'ny tady.Ny filaharan'ny tadin-damosina dia ADN tokana mirefy 50 nt eo ho eo, izay afaka mamorona firafitry ny volo ho azy.3 'Ny farany dia azo natao ho toy ny filaharana mifameno amin'ny ampahany ampahany amin'ny miRNA, avy eo ny kendrena miRNA dia azo ampifandraisina amin'ny filaharan'ny tady-loop mandritra ny fandikana mivadika, ary ny halavany dia mety hahatratra 70bp, izay mifanaraka amin'ny halavan'ny vokatra ampitomboina voafaritry ny qPCR.Tailing miRNA primer design.
Fikarohana manokana fanamafisam-peo:
Angon-drakitra fipoahana an-tserasera: fipoahana CottonFGD amin'ny fitovian'ny filaharana
Fipoahana eo an-toerana: Resaho ny fampiasana Blast + hanaovana fipoahana eo an-toerana, ny linux sy ny macos dia afaka mametraka mivantana ny angona eo an-toerana, ny rafitra win10 dia azo atao ihany koa aorian'ny fametrahana ubuntu bash.Mamorona angona momba ny fipoahana eo an-toerana sy ny fipoahana eo an-toerana;Sokafy ny ubuntu bash amin'ny win10.
Fanamarihana: Ny landihazo ambony sy ny landihazo nosy an-dranomasina dia voly tetraploid, ka ny vokatry ny fipoahana dia matetika lalao roa na maromaro.Taloha, ny fampiasana cd NAU ho angon-drakitra hanaovana fipoahana dia mety hahita fototarazo homologous roa tsy misy fahasamihafana SNP vitsivitsy monja.Amin'ny ankapobeny, ireo fototarazo homologous roa dia tsy azo sarahina amin'ny alàlan'ny famolavolana voalohany, noho izany dia raisina ho mitovy izy ireo.Raha misy indel miharihary, ny primer dia matetika natao amin'ny indel, fa izany dia mety hitarika ho amin'ny rafitra faharoa amin'ny primer Ny angovo maimaim-poana dia lasa ambony kokoa, mitarika amin'ny fihenan'ny fahombiazan'ny amplification, saingy tsy azo ihodivirana izany.

Famantarana ny rafitra faharoa voalohany:
Dingana:misokatra oligo 7 → filaharan'ny môdely fampidirana → fikandrana ambany → tehirizo → tadiavo ny primer amin'ny môdely, tsindrio ny ctrl+D mba hametrahana ny halavan'ny primer → hamakafaka ireo rafitra faharoa isan-karazany, toy ny vatana dimerization tena, heterodimer, hairpin, mismatch, sns. Ny sary roa farany amin'ny sary 4 dia ny valin'ny fitsapana ny primers.Ny vokatry ny voalohany primer dia tsara, tsy misy mazava dimer sy hairpin firafitry, tsy mitohy mifameno fototra, ary ny tena sandan'ny angovo maimaim-poana dia latsaky ny 4.5, raha ny aoriana primer mampiseho mitohy Ny fototra 6 dia mifameno, ary ny angovo maimaim-poana dia 8.8;Fanampin'izany, misy dimer matotra kokoa miseho eo amin'ny fiafaran'ny 3′, ary misy dimer misy fototra 4 misesy miseho.Na dia tsy avo aza ny angovo maimaim-poana, ny 3′ dimer Chl dia mety hisy fiantraikany lehibe amin'ny fanamafisana ny fanamafisana sy ny fahombiazan'ny fanamafisana.Ankoatra izany, dia ilaina ny manamarina ny hairpins, heterodimer, ary tsy mifanentana.

Fig3 oligo7 valim-pikarohana
Fanamafisana fahombiazana detection:
Ny fahombiazan'ny fampitomboana ny fihetsiky ny PCR dia misy fiantraikany lehibe amin'ny valin'ny PCR.Ao amin'ny qRT-PCR ihany koa, ny fahombiazan'ny amplification dia zava-dehibe indrindra amin'ny vokatra fatra.Esory ny akora hafa, milina ary protocole ao amin'ny buffer fanehoan-kevitra.Ny kalitaon'ny primer koa dia misy fiantraikany lehibe amin'ny fahombiazan'ny fanamafisana ny qRT-PCR.Mba hahazoana antoka ny fahamarinan'ny vokatra, na ny refin'ny fluorescence relatif sy ny fatran'ny fluorescence tanteraka dia mila mamantatra ny fahombiazan'ny fanamafisana ny primers.Ekena fa ny fahombiazan'ny fanamafisana qRT-PCR mahomby dia eo anelanelan'ny 85% sy 115%.Misy fomba roa:
1. Fomba curve mahazatra:
a.Afangaro ny cDNA
b.Fandotoana gradient
c.qPCR
d.Linear regression equation kajy ny fahombiazan'ny amplification
2. LinRegPCR
LinRegPCR dia programa famakafakana ny angona RT-PCR amin'ny fotoana tena izy, antsoina koa hoe data quantitative PCR (qPCR) mifototra amin'ny SYBR Green na simika mitovy.Ny programa dia mampiasa angona voahitsy tsy baseline, manao fanitsiana fototra amin'ny santionany tsirairay Misaraka, mamaritra ny varavarankely-n-linearity ary avy eo dia mampiasa famakafakana fihemorana amin'ny linear mba hifanaraka amin'ny tsipika mahitsy amin'ny alàlan'ny angon-drakitra PCR.Avy amin'ny tehezan'ity tsipika ity dia kajy ny fahombiazan'ny PCR isaky ny santionany.Ny salan'ny PCR mahomby isaky ny amplicon sy ny sanda Ct isaky ny santionany dia ampiasaina hanombanana ny fifantohana fanombohana isaky ny santionany, aseho amin'ny singa fluorescence tsy misy dikany.Ny fampidirana sy ny famoahana data dia amin'ny alàlan'ny takelaka Excel.Santionany ihany
ilaina ny fampifangaroana, tsy misy gradient
ilaina ny dingana:(Raiso ho ohatra ny Bole CFX96, fa tsy milina manana ABI mazava)
andrana:andrana qPCR mahazatra izy io.
Takelaka data qPCRNy LinRegPCR dia afaka mahafantatra endrika roa amin'ny rakitra vokarina: RDML na valin'ny fampitomboana.Raha ny marina dia ny sandan'ny fitiliana amin'ny fotoana tena izy amin'ny laharan'ny tsingerina sy ny famantarana fluorescence ataon'ny milina, ary ny fanamafisana dia azo amin'ny famakafakana ny sandan'ny fiovan'ny fluorescence amin'ny fahombiazan'ny fizarana linear.
Fifidianana data: Raha ny teoria dia tokony ho azo ampiasaina ny sanda RDML.Tombanana fa ny olan'ny solosainako dia ny tsy ahafahan'ny logiciel mahafantatra ny RDML, noho izany dia manana ny sanda mivoaka amin'ny excel ho toy ny angona tany am-boalohany aho.Amporisihina ny hanao fitiliana henjana amin'ny angon-drakitra aloha, toy ny tsy fahombiazan'ny fampidirana santionany, sns. Ny teboka dia azo esorina amin'ny angon-drakitra mivoaka (mazava ho azy fa tsy afaka mamafa azy ireo ianao, tsy hiraharaha ireo teboka ireo amin'ny dingana manaraka ny LinRegPCR)

Sary 5 qPCR fanondranana data

Fig6 fifantenana ny santionany kandidà

Fampidirana angona:Sokafy ny valin'ny fanamafisam-peo.xls, → sokafy LinRegPCR → rakitra → vakio avy amin'ny excel → safidio ny masontsivana araka ny aseho amin'ny sary 7 → OK → tsindrio mamaritra ny baselines

Fig7 dingana amin'ny fampidirana data linRegPCR

Vokatra:Raha tsy misy famerimberenana dia tsy ilaina ny vondrona.Raha misy miverimberina, dia azo ovaina ao amin'ny vondrona santionany ny vondrona, ary ampidirina ao amin'ny identifier ny anaran'ny fototarazo, ary avy eo dia ho voavondrona ho azy io fototarazo io.Farany, tsindrio ny rakitra, manondrana excel, ary jereo ny valiny.Haseho ny fahombiazan'ny amplification sy ny valin'ny R2 isaky ny lavadrano.Faharoa, raha mizara ho vondrona ianao, dia hiseho ny fahombiazan'ny amplification antonony voahitsy.Ataovy azo antoka fa eo anelanelan'ny 85% sy 115% ny fahombiazan'ny amplification isaky ny primer.Raha lehibe loatra na kely loatra dia midika izany fa ny fahombiazan'ny amplification ny primer dia ratsy.

Fig 8 Vokatra sy vokatra angona

Dingana andrana:
RNA fepetra takiana:
Fahadiovana:1.72.0 dia manondro fa mety misy isothiocyanate sisa.Ny asidra nokleika madio A260 / A230 dia tokony ho eo amin'ny 2 . Raha misy fisondrotana mahery amin'ny 230 nm, dia manondro fa misy zavatra organika toy ny ion phenate.Ankoatra izany, dia azo tsikaritra amin'ny 1,5% gel agarose electrophoresis.Tondroy ny marika, satria tsy misy denaturation ny ssRNA ary tsy misy fifandraisana tsipika ny logaritma lanja molekiola, ary tsy azo ambara tsara ny lanjan'ny molekiola.Concentration: Ara-teorikatsylatsaky ny 100ng/ul, raha ambany loatra ny fifantohana, ny fahadiovana amin'ny ankapobeny dia ambany fa tsy avo

Sary 9 RNA gel

Ankoatr'izay, raha sarobidy ny santionany ary avo ny fifantohana RNA, dia asaina manaparitaka azy io aorian'ny fitrandrahana, ary manalefaka ny ARN amin'ny fifantohana farany amin'ny 100-300ng / ul ho an'ny transcription mivadika.Inny dingan'ny transcription mivadika, rehefa mandika ny mRNA, ny primers oligo (dt) izay afaka mifatotra manokana amin'ny rambony polyA dia ampiasaina amin'ny fandikana mivadika, raha ny lncRNA sy ny circRNA dia mampiasa hexamer kisendrasendra (Random 6 mer) primers ho an'ny transcription mivadika amin'ny totalin'ny RNA Ho an'ny miRNA, miRNA-specific neck-loop primers dia ampiasaina amin'ny transcription mivadika.Orinasa maro ankehitriny no namoaka kitapo manokana.Ho an'ny fomba amam-panao, ny fomba tailing dia mety kokoa, avo lenta ary mamonjy reagent, fa ny vokatry ny fanavahana ny miRNA amin'ny fianakaviana iray dia tsy tokony ho tsara toy ny fomba amam-panao.Ny kitapo transcription mivadika tsirairay dia manana fepetra takiana amin'ny fifantohana ny fototarazo manokana (stem-loops).Ny fanondroana anatiny ampiasaina amin'ny miRNA dia U6.Ao anatin'ny dingan'ny famadihana ny tady, ny fantsona U6 dia tokony havadika misaraka, ary ny aloha sy aoriana amin'ny U6 dia tokony ampiana mivantana.Na ny circRNA sy ny lncRNA dia afaka mampiasa HKGs ho fanondroana anatiny.Infamantarana ny cDNA,
raha tsy misy olana amin'ny RNA dia tokony ho tsara koa ny cDNA.Na izany aza, raha enjehina ny fahalavorariana amin'ny fanandramana, dia tsara ny mampiasa fototarazo anatiny (Gene reference, RG) izay afaka manavaka ny gDNA amin'ny cd.Amin'ny ankapobeny, ny RG dia fototarazon'ny trano., HKG) araka ny aseho amin'ny sary 10;Tamin'izany fotoana izany dia nanao proteinina fitehirizana soja aho, ary nampiasa actin7 misy introns ho fanondroana anatiny.452bp ny haben'ny sombiny nohamafisin'ity primer ity ao amin'ny gDNA, ary raha cDNA no ampiasaina ho lasitra dia 142bp izany.Avy eo ny valin'ny fitsapana dia nahita fa ny ampahany amin'ny cDNA dia tena voapoitry ny gDNA, ary nanaporofo ihany koa fa tsy nisy olana tamin'ny vokatry ny fandikana mivadika, ary azo ampiasaina ho modely amin'ny PCR.Tsy ilaina ny mihazakazaka electrophoresis gel agarose mivantana miaraka amin'ny cDNA, ary tarika miparitaka izy io, izay tsy maharesy lahatra.

Sary 10. Fikarohana cDNA

Ny famaritana ny fepetra qPCRamin'ny ankapobeny dia tsy misy olana araka ny protocol amin'ny kitapo, indrindra amin'ny dingana amin'ny sanda tm.Raha toa ka tsy voavolavola tsara ny primer sasany mandritra ny famolavolana primer, ka miteraka fahasamihafana lehibe eo amin'ny sandan'ny tm sy ny 60°C teorika, dia asaina ny cDNA Aorian'ny fampifangaroana ireo santionany, dia manaova PCR mivaingana miaraka amin'ny primer, ary miezaha tsy hametraka ny mari-pana tsy misy bandy ho sanda TM.

Famakafakana angona

Ny fomba fanodinana PCR mahazatra fluorescence quantitative dia mifototra amin'ny 2-ΔΔCT.Môdely fanodinana data.

Vokatra mifandraika:

Real Time PCR mora^TM – Taqman

Real Time PCR mora^TM -SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix ho an'ny synthesis cDNA voalohany)

RT Easy II (Master Premix ho an'ny synthesis cDNA voalohany ho an'ny qPCR)