Overview
Famantarana haingana ny zavamaniry transgenika
Text/Tong Yucheng
Operation andrana/Han Ying
Editor/Wen Youjun
Words/1600+
Fotoana famakiana soso-kevitra/8-10 minitra
Famantarana haingana ny zavamaniry transgenika
Amin'ny maha olom-baovao ao amin'ny laboratoara, dia tsy asa tsara ny manara-maso ireo zavamaniry tsara avy amin'ny andian-javamaniry manana tahan'ny fiovam-po ambany.Voalohany, ny ADN dia tsy maintsy alaina tsirairay avy amin'ny santionany maro, ary avy eo dia ho hitan'ny PCR ny fototarazo vahiny.Na izany aza, ny valiny dia matetika banga sy bandy miaraka amin'ny singa vitsivitsy indraindray, saingy tsy azo atao ny mamaritra raha misy tsy hita na fahitana diso..Tena tsy afa-manoatra ve ny miatrika dingana sy vokatra andrana toy izany?Aza manahy fa mampianatra anao ny fomba fisavana ireo zavamaniry tsara transgenika mora sy marina ny rahalahy.
Dingana 1: Design detection primers
Farito ny fototarazo endogenous sy ny fototarazo exogenous ho hita araka ny santionany hotsapaina, ary mifidiana solontena 100-500bp filaharana ao amin'ny fototarazo ho an'ny famolavolana primer.Ny primer tsara dia afaka miantoka ny fahamarinan'ny valim-pikarohana ary manafohy ny fotoana fitiliana (jereo ny appendice ho an'ny primers fitiliana fampiasa matetika).
Fanamarihana:
Ny primer vao novolavolaina dia mila manatsara ny toetry ny fanehoan-kevitra ary manamarina ny fahamarinan'ny marina, ny fahitsiana ary ny fetran'ny fitiliana alohan'ny hanaovana fitiliana lehibe.
Dingana 2:Mamorona protocole andrana
Fanaraha-maso tsara: Ampiasao ny ADN voadio misy ny sombintsombiny kendrena ho lasitra hamaritana raha ara-dalàna ny rafi-pandrefesana PCR sy ny fepetra.
Fanaraha-maso ratsy / banga: Mampiasà môdely ADN na ddH2O izay tsy ahitana ny sombintsombiny kendrena ho môdely hamantarana raha misy loharanon'ny loto ao amin'ny rafitra PCR.
Fanaraha-maso anatiny: ampiasao ny fitambaran'ny fototarazo endogenous amin'ny santionany ny fitambaran'ny primer/probe mba hotsapaina raha mety ho hitan'ny PCR ilay môdely.
Fanamarihana:
Ny fanaraha-maso tsara, négatif/blank ary ny fanaraha-maso anatiny dia tokony apetraka isaky ny fitsapana mba hanombanana ny fahamarinan'ny valin'ny andrana.
Dingana 3: Fiomanana andrana
Alohan'ny hampiasana dia diniho raha mifangaro tsara ny vahaolana.Raha hita ny rotsak'orana dia mila levona sy afangaro araka ny toromarika alohan'ny fampiasana.Ny fangaro 2×PCR dia mila atao pipette ary afangaro imbetsaka amin'ny micropipette alohan'ny hampiasana azy mba hialana amin'ny fitsinjarana ion tsy mitovy.
Fanamarihana:
Raiso ny toromarika ary vakio tsara, ary manaova fiomanana alohan'ny andrana mifanaraka amin'ny toromarika.
Dingana 4: Manomana rafitra fanehoan-kevitra PCR
Araka ny protocol andrana, afangaro ny primers, H2O, 2×PCR mix, centrifuge ary zarao amin'ny fantsona fanehoan-kevitra tsirairay.
Fanamarihana:
Ho an'ny fitsapana lehibe na maharitra, dia asaina mampiasa rafitra fanehoan-kevitra PCR misy enzyme UNG, izay afaka misoroka ny fandotoana aerosol vokatry ny vokatra PCR.
Dingana 5: Ampio modely fanehoan-kevitra
Amin'ny fampiasana teknolojia PCR mivantana, tsy ilaina ny dingana fanadiovana asidra nokleika mandreraka.Ny môdely santionany dia azo omanina ao anatin'ny 10 minitra ary ampidirina amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR mifanaraka amin'izany.
Fanamarihana:
Ny fomba Lysis dia manana fiantraikany tsara kokoa, ary ny vokatra azo dia azo ampiasaina amin'ny fanehoan-kevitra marobe.
5.1: PCR mivantana amin'ny ravina
Araka ny haben'ny sary ao amin'ny boky torolalana, tapaho ny tavy ravina misy savaivony 2-3mm ary apetraho ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR.
Fanamarihana: Ataovy azo antoka fa miroboka tanteraka amin'ny vahaolana PCR ny sombin-dravina, ary aza asiana tavy be loatra.
5.2: Fomba fanalana ravina
Hetezo ny tavy ravina misy savaivony 5-7mm ary apetraho ao anaty fantsona centrifuge.Raha misafidy ravina matotra ianao dia aza mampiasa ny tadin'ny lalan-dravina lehibe.Pipette 50ul Buffer P1 lysate ao anaty fantsona centrifuge mba hahazoana antoka fa ny lysate dia afaka mandentika tanteraka ny tadin'ny ravina, apetraho ao anaty cycler mafana na fandroana metaly, ary lyse amin'ny 95 ° C mandritra ny 5-10 minitra.
Ampio 50ul Buffer P2 neutralization vahaolana ary afangaro tsara.Ny lysate vokatr'izany dia azo ampiasaina ho modely ary ampiana amin'ny rafitra fanehoan-kevitra PCR.
Fanamarihana: Ny habetsaky ny môdely dia tokony ho eo anelanelan'ny 5-10% amin'ny rafitra PCR, ary tsy tokony hihoatra ny 20% (ohatra, amin'ny rafitra PCR 20μl, ampio 1-2μl ny buffer lysis, tsy mihoatra ny 4μl).
Dingana 6: PCR Reaction
Aorian'ny fametahana ny fantsona PCR dia apetraho ao anaty fitaovana PCR izy ireo mba hanamafisana.
Fanamarihana:
Ny fanehoan-kevitra dia mampiasa môdely tsy voadio ho an'ny amplification, noho izany ny isan'ny tsingerin'ny fanamafisam-peo dia tsingerina 5-10 bebe kokoa noho ny rehefa mampiasa môdely ADN voadio.
Dingana 7: Fikarohana electrophoresis sy famakafakana vokatra
M: 100bp ADN Tohatra
1\4: Fomba ADN voadio
2\5: Fomba PCR mivantana
3\6: Fanaraha-maso banga
Fanaraha-maso kalitao:
Ny valin'ny fitsapana amin'ny fanaraha-maso isan-karazany napetraka ao amin'ny andrana dia tokony mahafeno ireto fepetra manaraka ireto.Raha tsy izany, ny antony mahatonga ny olana dia tokony hodinihina, ary ny fitsapana dia tokony hatao indray rehefa afaka ny olana.
Tabilao 1. Valin'ny fitsapana mahazatra amin'ny vondrona mpanara-maso isan-karazany
*Rehefa ampiasaina ho fanaraha-maso tsara ny plasmid, dia mety ho ratsy ny valin'ny fitsapana fototarazo endogenous
Vokany fitsarana:
A. Ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo endogen ao amin'ny santionany dia ratsy, izay manondro fa ny ADN mety amin'ny fitiliana PCR mahazatra dia tsy azo esorina amin'ny santionany na ny ADN nalaina dia misy inhibitory fanehoan-kevitra PCR, ary ny ADN dia tokony alaina indray.
B. Ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo endogenous amin'ny santionany dia tsara, ary ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo exogenous dia ratsy, izay manondro fa ny ADN mety amin'ny fitiliana PCR mahazatra dia nalaina avy amin'ny santionany, ary azo tsaraina fa ny XXX dia tsy hita ao amin'ny santionany.
C. Ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo endogen amin'ny santionany dia tsara, ary ny valin'ny fitsapana amin'ny fototarazo exogenous dia tsara, izay manondro fa ny ADN mety amin'ny fitiliana PCR mahazatra dia nalaina tamin'ny santionany, ary ny ADN santionany dia misy ny fototarazo XXX.Azo atao bebe kokoa ny fanandramana fanamafisana.
Dingana 8: Design detection primers
Aorian'ny andrana dia ampiasao ny 2% ny sodium hypochlorite solution sy ny 70% ethanol solution hamafa ny faritra andrana mba hisorohana ny fandotoana ny tontolo iainana.
Fanazavana fanampiny
Tabilao 2. Ny primer fampiasa matetika amin'ny fitiliana PCR amin'ny ankapobeny ny zava-maniry novaina
Taratasy fanondroana:
SN/T 1202-2010, Qualitative PCR detection method for genetically modified plant ingredients in food.
Fanambarana avy amin'ny Minisiteran'ny Fambolena 1485-5-2010, Fitsapana ny akora amin'ny zavamaniry novaina génétique sy ny vokatra azony - vary M12 sy ny vokatra azo avy aminy.
Fotoana fandefasana: Jun-09-2021
