Ⅰ. Ampitomboy ny fahatsapan'ny rafitra fanehoan-kevitra:
1. Asaraho ny ARN avo lenta:
Ny synthesis cDNA mahomby dia avy amin'ny ARN avo lenta.Ny ARN avo lenta dia tokony hiantoka farafahakeliny farafahakeliny ary tsy misy inhibitors izay tsy misy enzymes firaketana, toy ny EDTA na SDS.Ny kalitaon'ny RNA dia mamaritra ny sanda ambony indrindra amin'ny fampahalalana filaharana azonao adika amin'ny cDNA.Ny fomba fanadiovana RNA ankapobeny dia fomba dingana amin'ny fampiasana isocyanate / acidophenol.Mba hisorohana ny fandotoana ny RNase, ny RNA misaraka amin'ny santionany manankarena amin'ny RNase (toy ny pancreas) dia mitaky fitehirizana formaldehyde mba hamonjena ny ARN avo lenta, izay vao mainka ho an'ny fitehirizana maharitra.Ny ARN nalaina tao amin'ny atin'ny voalavo dia simba tamin'ny ankapobeny taorian'ny herinandro nitehirizana azy tao anaty rano, fa ny ARN nalaina tamin'ny voalavo dia nitoetra ho mafy orina taorian'ny telo taona nitehirizana azy tao anaty rano.Ho fanampin'izany, ny transcript lehibe kokoa noho ny 4kb dia saro-pady kokoa amin'ny fanaraha-maso ny fahasimban'ny RNase noho ny transcript kely.Mba hampitomboana ny fahamarinan'ny santionany RNA fitehirizana, ny ARN dia azo levona ao anaty methalmamine misy ion, ary voatahiry -70 °C.Tsy tokony hisy zavatra isan-karazany manimba ny ARN ny Thylide ampiasaina amin'ny fitahirizana RNA.Ny ARN, izay avy amin'ny pancreas, dia azo tehirizina ao anaty methalmamine mandritra ny herintaona farafahakeliny.Rehefa vonona ny hampiasa ARN ianao, dia azonao atao ny mampiasa ireto fomba manaraka ireto mba handresena ny ARN: ampio NaCl amin'ny 0,2m ary in-4 ny habetsahan'ny ethanol, apetraho mandritra ny 3-5 minitra ny mari-pana ao amin'ny efitrano, ary 10,000 × g centrifugal mandritra ny 5 minitra.
2. Mampiasà transcriptase mivadika tsy misy hetsika RNaseH (RNaseH-):
Ny inhibitors RNase dia matetika ampiana amin'ny fanehoan-kevitry ny transcription mba hampitombo ny halavany sy ny vokatra amin'ny synthesis cDNA.Ny inhibitor RNase dia ampiana amin'ny fanehoan-kevitry ny synthesis rojo voalohany amin'ny fisian'ny buffers sy ny fampihenana toy ny DTT satria ny dingan'ny synthesis alohan'ny cDNA dia manala ny inhibitor, ka mamoaka RNases mifatotra izay manimba ny RNA.Ny inhibitor proteinina RNase dia manakana ny fahapotehan'ny RNA amin'ny RNase A, B, C, ary tsy manakana ny RNases amin'ny hoditra, noho izany dia tokony hotandremana ny tsy hampiditra RNases avy amin'ny rantsantanana na dia eo aza ny fampiasana ireo inhibitors ireo.
Ny reverse transcriptase dia mampiakatra ny fiovan'ny RNA ho cDNA.Samy manana hetsika RNaseH endogenous ny M-MLV sy AMV ankoatry ny hetsika polymerase azy manokana.Ny hetsika RNaseH dia mifaninana amin'ny hetsika polymerase ho an'ny tady heterozygous miforona eo anelanelan'ny modely RNA sy ny primer ADN na tady fanitarana cDNA, ary manimba ny ARN: tady RNA ao amin'ny complexes ADN.Tsy azo ampiasaina ho substrate mahomby ho an'ny synthesis cDNA intsony ny maodely RNA nopotehin'ny hetsika RNaseH, mampihena ny vokatra sy ny halavan'ny synthesis cDNA.Noho izany, ny fanafoanana na ny fampihenana be ny asan'ny RNaseH amin'ny transcriptase mivadika dia mety ho tombontsoa lehibe.
SuperScriptⅡ reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase an'ny RNaseH- ary thermoScript reverse transcriptase, AMV an'ny RNaseH- dia nanome cDNA feno kokoa noho ny MMLV sy AMV.Ny fahatsapan'ny RT-PCR dia misy fiantraikany amin'ny habetsahan'ny cDNA voaforona.ThermoScript dia saro-pady kokoa noho ny AMV.Ny haben'ny vokatra RT-PCR dia voafetra amin'ny fahafahan'ny transcriptase mivadika mamolavola cDNA, indrindra rehefa manao cloning Cdnas lehibe kokoa.Raha ampitahaina amin'ny MMLV, SuperScripⅡ dia nampitombo be ny vokatra vokatra RT-PCR lava.Ny transcriptase mivadika amin'ny RNaseH- koa dia mampitombo ny fahamarinan-toerana mafana, noho izany dia azo atao amin'ny hafanana ambony noho ny mahazatra amin'ny 37-42 ℃ ny fanehoan-kevitra.Eo ambanin'ny fepetra synthesis soso-kevitra, ny oligo (dT) primer sy 10μCi [alpha-p] dCTP dia nampiasaina.Ny totalin'ny famokarana rojo voalohany dia nokajiana tamin'ny alàlan'ny fomba rotsak'orana TCA.Ny cDNA feno lava dia nodinihina tamin'ny alàlan'ny fanesorana ny tsipika misy habe ary manisa amin'ny gel agarose alkaline.
3. Ampitomboy ny mari-pana amin'ny fitehirizana hafanana amin'ny transcription mivadika:
Ny hafanan'ny fihazonana ambony kokoa dia manampy amin'ny fanokafana ny rafitra faharoa an'ny ARN ary mampitombo ny vokatry ny fanehoan-kevitra.Ho an'ny ankamaroan'ny maodely RNA, ny fitazonana ny RNA sy ny primer amin'ny 65 ° C tsy misy buffer na sira ary avy eo mangatsiaka azy ireo haingana amin'ny ranomandry dia manafoana ny ankamaroan'ny rafitra faharoa ary mamela ny primer mba hamatotra.Na izany aza, ny modely sasany dia mbola manana rafitra faharoa, na dia aorian'ny denaturation mafana aza.Ny fampitomboana ireo maodely sarotra ireo dia azo atao amin'ny alàlan'ny ThermoScript reverse transcriptase ary amin'ny fametrahana ny reverse transcriptase reaction amin'ny mari-pana ambony kokoa mba hanatsarana ny fanamafisana.Ny hafanan'ny fihazonana avo kokoa dia mety hampitombo ny mari-pahaizana manokana, indrindra rehefa atao ny synthesis cDNA amin'ny fampiasana primers manokana momba ny fototarazo (GSPS) (jereo ny Toko 3).Raha mampiasa GSP, dia ataovy izay hahazoana antoka fa ny sandan'ny Tm an'ny primer dia mitovy amin'ny mari-pana andrasana.Aza mampiasa oligo (dT) sy primer kisendrasendra mihoatra ny 60 ℃.Ny primer kisendrasendra dia mila atao amin'ny 25 ℃ mandritra ny 10 minitra alohan'ny hampitomboana ny 60 ℃.Ho fanampin'ny fampiasana ny mari-pana transcription mivadika ambony kokoa, dia azo hatsaraina ny manokana amin'ny alàlan'ny famindrana mivantana ny fangaro RNA / primer avy amin'ny mari-pana denaturing 65 ℃ mankany amin'ny mari-pana mitazona transcription mivadika ary manampy fifangaroan-dresaka 2 × efa mafana (cDNA thermal initiation synthesis).Ity fomba fiasa ity dia manampy amin'ny fisorohana ny fifamatorana fototra intermolecular izay mitranga amin'ny hafanana ambany kokoa.Ny fampiasana fitaovana PCR dia manamora ny fiovaovan'ny maripana ilaina amin'ny RT-PCR.
Tth polymerase stabilité hafanana dia miasa toy ny ADN polymerase eo anatrehan'ny Mg2+ sy RNA polymerase eo anatrehan'ny Mn2+.Mahazaka hafanana hatramin'ny 65 ℃.Na izany aza, ny fisian'ny Mn2 + mandritra ny PCR dia mampihena ny tsy fivadihana, izay mahatonga ny Tth polymerase ho tsy mety amin'ny fanamafisana avo lenta, toy ny cDNA cloning.Ankoatr'izay, ny Tth dia tsy mahomby amin'ny fandikana mivadika, izay mampihena ny fahatsapana, ary satria ny enzyme tokana dia afaka manatanteraka transcription mivadika sy PCR, ny fanehoan-kevitra mifehy tsy misy fandikana mivadika dia tsy azo ampiasaina hanavahana ny vokatra ampitomboina amin'ny cDNA amin'ny an'ny ADN genomika voapoizina.
4. Additive izay mampiroborobo ny fandikana mivadika:
Ny fanampim-panampiana, anisan'izany ny glycerin sy DMSO, amin'ny fanehoan-kevitra synthesis rojo voalohany dia mety hampihena ny fahamarinan'ny tadin'ny asidra nukleika roa ary manala ny rafitra faharoa RNA.Ny glycerine hatramin'ny 20% na 10% DMSO dia azo ampiana nefa tsy misy fiantraikany amin'ny asan'ny SuperScriptⅡ na MMLV.AMV ihany koa dia afaka mandefitra hatramin'ny 20% glycerol nefa tsy mampihena ny asa.Mba hanamafisana ny fahatsapan'ny RT-PCR ao amin'ny SuperScriptⅡ reverse transcription reaction, 10% glycerol dia azo ampiana sy insulated amin'ny 45 ℃.Raha ampiana amin'ny PCR ny 1/10 amin'ny vokatra retrotranscription-rection, dia 0,4% ny fifantohana amin'ny glycerol amin'ny fanehoan-kevitra fanamafisana, izay tsy ampy hanakanana ny PCR.
5. Fanodinana RNaseH:
Ny fahatsapan-tena dia azo hatsaraina amin'ny fitsaboana ny fanehoan-kevitry ny cDNA amin'ny RNaseH alohan'ny PCR.Ho an'ny maodely sasany, heverina fa ny RNA ao amin'ny fanehoan-kevitry ny cDNA synthesis dia manakana ny famatorana ny vokatra ampitomboina, ka ny fitsaboana RNaseH dia mety hampitombo ny fahatsapana.Amin'ny ankapobeny, ny fitsaboana RNaseH dia ilaina amin'ny fanamafisana ny môdely kendrena cDNA feno lava lava, toy ny tuberous scherosisⅡ miaraka amin'ny dika mitovy.Ho an'ity môdely sarotra ity, ny RNaseH dia nanatsara ny famantarana novokarin'ny cDNA novolavolain'ny SuperScriptⅡ na AMV.Ho an'ny ankamaroan'ny fanehoan-kevitry ny RT-PCR, ny fitsaboana RNaseH dia tsy voatery satria ny dingana denaturation PCR misy insulated 95 ℃ matetika dia mamadika ny RNA avy amin'ny RNA: complex DNA.
6. Fomba nohatsaraina hamantarana ny ARN kely:
Ny RT-PCR dia sarotra indrindra raha RNA kely ihany no misy.Ny fampidirana glycogène ho mpitatitra mandritra ny fisarahana amin'ny ARN dia manampy amin'ny fampitomboana ny vokatra santionany kely.Ny glycogen tsy misy RNase dia azo ampiana miaraka amin'ny Trizol.Ny glycogène dia levona anaty rano ary afaka mijanona ao amin'ny dingan-drano miaraka amin'ny ARN mba hanampy amin'ny rotsak'orana manaraka.Ny fifantohana amin'ny glycogène tsy misy RNase dia 250μg / ml ho an'ny santionany latsaky ny 50mg amin'ny tavy na sela 106 kolontsaina.
Ny fanampiana BSA acetylated amin'ny famerenana ny fanehoan-kevitry ny transcription amin'ny fampiasana SuperScriptⅡ dia mety hampitombo ny fahatsapana, ary ho an'ny RNA kely, mampihena ny habetsaky ny SuperScriptⅡ ary manampy singa 40 RnaseOut nuclease inhibitor dia afaka manatsara ny haavon'ny fitiliana.Raha glycogène no ampiasaina amin'ny fisarahan'ny RNA, dia mbola asaina ny fampidirana BSA na RNase inhibitors hamadika ny fanehoan-kevitry ny transcription amin'ny fampiasana SuperScriptⅡ.
Ⅱ. Ampitomboy ny fahasamihafan'ny RT-PCR
1. cNDA synthesis:
Fomba telo samihafa no azo ampiasaina hanombohana ny synthesis cDNA tady voalohany, ary ny fahasamihafan'ny fomba tsirairay dia misy fiantraikany amin'ny habetsahana sy ny karazana cDNA voarafitra.
Ny fomba primer kisendrasendra no kely indrindra amin'ireo fomba telo.Apetaho amin'ny toerana maro manerana ny transcript ny primer mba hamokarana cDNA fohy sy ampahany.Ity fomba ity dia matetika ampiasaina mba hahazoana 5′ terminal sequences sy cDNA avy amin'ny RNA templates miaraka amin'ny faritra ara-drafitra faharoa na amin'ny toerana famaranana izay tsy afaka mamerina ny transcriptase.Mba hahazoana ny cDNA lava indrindra, ny tahan'ny primers amin'ny RNA amin'ny santionany RNA tsirairay dia mila faritana amin'ny fomba empirically.Ny fifantohana voalohany amin'ny primer kisendrasendra dia manomboka amin'ny 50 ka hatramin'ny 250ng isaky ny rafitra fanehoan-kevitra 20μl.Satria ny cDNA novolavolaina avy amin'ny totalin'ny RNA mampiasa primer kisendrasendra dia ribosomal RNA indrindra indrindra, ny poly(A)+RNA dia voafantina amin'ny ankapobeny ho modely.
Ny fanombohana Oligo (dT) dia voafaritra kokoa noho ny primer kisendrasendra.Izy io dia mitambatra amin'ny rambony poly(A) hita amin'ny faran'ny 3′ amin'ny mRNA amin'ny ankamaroan'ny sela eukaryotic.Satria ny poly(A) + RNA dia eo amin'ny 1% hatramin'ny 2% amin'ny totalin'ny RNA, ny habetsaky ny cDNA sy ny fahasarotan'ny cDNA dia kely kokoa noho ny fampiasana primer kisendrasendra.Noho ny maha manokana azy, ny oligo(dT) amin'ny ankapobeny dia tsy mila fanatsarana ny RNA amin'ny ratio primer sy ny fifantenana poly(A)+.Aroso ny mampiasa 0.5μg oligo(dT) isaky ny rafitra fanehoan-kevitra 20μl.oligo(dT)12-18 dia mety amin'ny ankamaroan'ny RT-PCR.Ny ThermoScript RT-PCR System dia manome oligo(dT)20 noho ny fahamarinany mafana tsara ary mety amin'ny mari-pana ambony kokoa.
Gene-specific primers (GSP) no primer manokana tsara indrindra ho an'ny dingana transcription mivadika.Ny GSP dia oligonucleoside antisense izay afaka mampifangaro manokana amin'ny filaharan'ny RNA, fa tsy mametaka ny Rnas rehetra toy ny primer kisendrasendra na oligo(dT).Ny fitsipika ampiasaina amin'ny famolavolana primer PCR dia mihatra amin'ny famolavolana ny fanehoan-kevitra GSP mivadika.Ny GSP dia mety ho toy ny filaharana mitovy amin'ny fanamafisam-peo mipetaka eo amin'ny faran'ny mRNA3′, na ny GSP dia azo natao ho an'ny annealed midina miaraka amin'ny primer amplification mivadika.Ho an'ny zavatra ampitomboina sasany, ilaina ny mamolavola primer antisense mihoatra ny iray ho an'ny RT-PCR mahomby satria ny rafitra faharoa amin'ny RNA kendrena dia mety manakana ny primer tsy hamatotra.Soso-kevitra ny hampiasa 1pmol antisense GSP amin'ny rafitra fanehoan-kevitra synthesis rojo voalohany amin'ny 20μl.
2. Ampitomboy ny mari-pana amin'ny fitehirizana hafanana amin'ny transcription mivadika:
Mba hanararaotra tanteraka ny mari-pamantarana GSP, dia tokony hampiasaina ny transcriptase mivadika miaraka amin'ny fahamarinan-toerana mafana.Ny transcriptase mifamadika amin'ny hafanana dia azo asiana insulate amin'ny mari-pana ambony kokoa mba hampitomboana ny hamafin'ny fanehoan-kevitra.Ohatra, raha asiana GSP amin'ny 55 ° C, dia tsy ampiasaina tanteraka ny fanoritsoritana ny GSP raha toa ka atao amin'ny 37 ° C ny fandikana mivadika amin'ny alàlan'ny AMV na M-MLV.Na izany aza, ny SuperScripⅡ sy ThermoScript dia afaka mihetsika amin'ny 50 ℃ na ambony, izay manafoana ireo vokatra tsy voafaritra vokarina amin'ny mari-pana ambany kokoa.Ho an'ny mari-pamantarana ambony indrindra, ny fangaro RNA/primer dia azo afindra mivantana avy amin'ny mari-pana denaturation 65 ℃ mankany amin'ny mari-pana mitazona transcription mivadika miaraka amin'ny fampifangaroana fanehoan-kevitra 2 x efa nafanaina (fanombohana mafana ny synthesis cDNA).Izany dia manampy amin'ny fisorohana ny fampiraisana fototra eo amin'ny molekiola amin'ny hafanana ambany.Ny fampiasana fitaovana PCR dia manamora ny fiovan'ny mari-pana ilaina amin'ny RT-PCR.
3. Ahena ny fandotoana ny ADN:
Ny olana iray mety hitranga amin'ny RT-PCR dia ny fandotoana ny ADN génomika ny ARN.Ny fampiasana fomba fisarahana RNA tsara kokoa, toy ny Trizol Reagent, dia mampihena ny fandotoana ADN amin'ny fiomanana RNA.Mba hisorohana ny vokatra vokarina avy amin'ny ADN génomika, ny ARN dia azo tsaboina amin'ny DnasⅠ kilasy fanamafisam-peo mba hanesorana ny ADN voaloto alohan'ny hamerenana ny fandikana.Ny santionany dia notazonina tamin'ny 65 ℃ tao amin'ny 2.0mM EDTA nandritra ny 10 minitra mba hampitsaharana ny fandevonan-kanina DNaseⅠ.EDTA chelates magnesium ion mba hisorohana ny magnésium ion miankina RNA hydrolysis izay mitranga amin'ny hafanana ambony.
Mba hanasarahana ny cDNA amplified amin'ny vokatra fanamafisam-peo ADN, dia azo atao ny manamboatra primer izay misaraka amin'ny exon misaraka.Ny vokatra PCR azo avy amin'ny cDNA dia ho fohy kokoa noho ny azo avy amin'ny ADN genomika voapoizina.Ny fanandramana voafehy tsy misy fandikana mivadika koa dia atao amin'ny môdely RNA tsirairay mba hamaritana raha avy amin'ny ADN na cDNA ny sombiny iray.Ny vokatra PCR azo amin'ny tsy fisian'ny transcription mivadika dia avy amin'ny genome.
Vokatra mifandraika
-Ny kitapo tokana dia ahafahan'ny transcription mivadika sy ny PCR atao ao anaty fantsona iray ihany.Mila ampiana RNA template, primer PCR manokana ary RNase-Free ddH2O.
-Ny famakafakana fatran'ny ARN amin'ny fotoana tena izy dia azo atao haingana sy marina.
-Ny kitapo dia mampiasa reagent foregene reverse transcription tsy manam-paharoa sy Foregene HotStar Taq DNA Polymerase miaraka amina rafitra fanehoan-kevitra tokana mba hanatsarana ny fahombiazan'ny amplification sy ny maha-tokana ny fanehoan-kevitra.
-Ny rafitra fanehoan-kevitra optimized dia mahatonga ny fanehoan-kevitra hanana fahatsapana avo lenta kokoa, fahatoniana mafana kokoa, ary fandeferana tsara kokoa.
- Fahaizana mahomby manala ny gDNA, izay afaka manala ny gDNA ao amin'ny môdely ao anatin'ny 2 minitra.
-Rafitra transcription mivadika mahomby, 15 minitra monja no hamitana ny synthesis ny cDNA tady voalohany.
-Modely saro-takarina: ireo maodely manana votoaty GC avo lenta sy rafitra faharoa sarotra dia azo averina amin'ny fahombiazana avo.
-Rafitra transcription mivadika avo lenta, ny maodely pg-level dia afaka mahazo cDNA avo lenta ihany koa.
-Ny rafitra transcription mivadika dia manana fahamarinan-toerana mafana avo lenta, ny mari-pana fanehoan-kevitra tsara indrindra dia 42 ℃, ary mbola manana fampisehoana transcription tsara amin'ny 50 ℃.
Fotoana fandefasana: Mar-07-2023
