1. Fahalalana fototra (raha te-hahita ny ampahany andrana ianao dia alefaso mivantana any amin'ny tapany faharoa)
Amin'ny maha fanehoan-kevitry ny PCR mahazatra, ny PCR Real Time dia manara-maso indrindra ny fiovan'ny habetsahan'ny vokatra amplification isaky ny tsingerin'ny fihetsiketsehan'ny PCR amplification amin'ny fotoana tena izy amin'ny alàlan'ny fiovan'ny mari-pamantarana fluorescence, ary mamakafaka ny modely fanombohana amin'ny fifandraisana misy eo amin'ny sanda ct sy ny curve mahazatra.
Ireo singa mifandraika amin'ny RT-PCRfototra, fluorescence tokonam-baravaranaSYCt sanda.
| fototra: | Ny sandan'ny fluorescence amin'ny tsingerina faha-3-15 dia ny baseline (baseline), izay vokatry ny fahadisoana tsindraindray amin'ny fandrefesana. |
| tokonam-baravarana (threshold): | Enti-milaza ny fetran'ny fitsirihana ny fluorescence napetraka amin'ny toerana mety amin'ny faritra fitomboan'ny fitomboana amin'ny curve fanamafisam-peo, amin'ny ankapobeny dia avo 10 heny noho ny fivilian-dàlana mahazatra. |
| sandan'ny CT: | Io no isan'ny tsingerin'ny PCR rehefa mahatratra ny tokonam-baravarana ny sandan'ny fluorescence amin'ny fantsona fanehoan-kevitra tsirairay. Ny sanda Ct dia mifanohitra amin'ny habetsaky ny môdely voalohany. |
Fomba fametahana mahazatra ho an'ny RT-PCR:
| FOMBA | HAHASOA | toetra izy | sehatra fampiharana |
| SYBR GreenⅠ | Wide azo ampiharina, saro-pady, mora sy mety | Ny fepetra fototra dia avo, mora amin'ny tarika tsy voafaritra | Izy io dia mety amin'ny famakafakana fatran'ny fototarazo kendrena isan-karazany, fikarohana momba ny fanehoana ny fototarazo, ary fikarohana momba ny biby sy zavamaniry rekombinan'ny transgenika. |
| TaqMan | specificity tsara sy avo repeatability | Ny vidiny dia avo ary mety amin'ny tanjona manokana ihany. | Famantarana ny pathogen, fikarohana fototarazo fanoherana ny zava-mahadomelina, fanombanana ny fahombiazan'ny zava-mahadomelina, fitiliana ny aretina fototarazo. |
| molekiola fanilo | High specificity, fluorescence, ambany fiaviana | Lafo ny vidiny, mety amin'ny tanjona manokana ihany, sarotra ny famolavolana, ary lafo ny vidiny. | Famakafakana fototarazo manokana, fanadihadiana SNP |
2. Dingana andrana
2.1 Momba ny vondrona andrana- tsy maintsy misy lavaka fantsakana maromaro ao amin'ny vondrona, ary tsy maintsy misy famerimberenana biolojika.
| ① | Fanaraha-maso banga | Ampiasaina hamantarana ny toetry ny fitomboan'ny sela amin'ny andrana |
| ② | SiRNA fanaraha-maso ratsy (sequence siRNA tsy voafaritra) | Asehoy ny maha-tokana ny hetsika RNAi.Ny siRNA dia mety hiteraka valin-kafatra tsy voafaritra amin'ny fifantohana 200nM. |
| ③ | Fanaraha-maso Transfection Reagent | Esory ny poizina amin'ny reagent transfection amin'ny sela na ny fiantraikany amin'ny fanehoana ny fototarazo kendrena. |
| ④ | siRNA manohitra ny fototarazo kendrena | Atsaharo ny fanehoana ny fototarazo kendrena |
| ⑤ (tsy voatery) | siRNA positive | Ampiasaina amin'ny famahana olana amin'ny rafitra andrana sy ny olan'ny asa |
| ⑥ (tsy voatery) | Fanaraha-maso fluorescent siRNA | Ny fahombiazan'ny fifindran'ny sela dia azo jerena amin'ny mikraoskaopy |
2.2 Fitsipiky ny famolavolana primer
| Haben'ny sombiny nohamafisina | Ny tsara indrindra amin'ny 100-150bp |
| Halavany voalohany | 18-25bp |
| GC votoaty | 30%-70%, tsara indrindra 45%-55% |
| Tm sanda | 58-60 ℃ |
| filaharana | Fadio ny T/C mitohy;A/G mitohy |
| 3 filaharan'ny farany | Halaviro ny mpanankarena GC na mpanankarena AT;ny fototry ny terminal dia G na C;tsara ny misoroka ny T |
| fifamenoana | Fadio ny filaharana mifameno amin'ny fototra mihoatra ny 3 ao anatin'ny primer na eo anelanelan'ny primer roa |
| manokana | Ampiasao ny fikarohana fipoahana hanamafisana ny maha-tokana ny primer |
①SiRNA dia karazana manokana, ary ny filaharan'ny karazana samihafa dia tsy mitovy.
②SiRNA dia fonosina amin'ny vovoka maina mangatsiaka, izay azo tehirizina mafy mandritra ny herinandro 2-4 amin'ny mari-pana.
2.3 Fitaovana na réagents mila omanina mialoha
| Primer (fanondro anatiny) | Ao anatin'izany ny roa mandroso sy miverina |
| Primers (geno kendrena) | Ao anatin'izany ny roa mandroso sy miverina |
| Target Si RNA (3 strips) | Amin'ny ankapobeny, ny orinasa dia hanao synthesize 3 strips, ary avy eo mifidy ny iray amin'ireo telo amin'ny RT-PCR |
| Kit famindran-toerana | Lipo2000 sy. |
| RNA Rapid Extraction Kit | Ho an'ny fitrandrahana RNA aorian'ny fifindrana |
| Kit fandikana haingana mivadika | ho an'ny synthesis cDNA |
| PCR Amplification Kit | 2×Super SYBR Green qPCR Master Mix |
2.4 Momba ny olana tokony hojerena amin'ny dingana andrana manokana:
①siRNA fifindran'ny dingana
1. Ho an'ny fametahana, azonao atao ny misafidy lovia 24-well, 12-well plate na 6-well plate (ny salan'isan'ny ARN fifantohana atolotra isaky ny lavadrano 24-lava lovia dia eo amin'ny 100-300 ng / uL), ary ny optimum transfection hakitroky ny sela dia hatramin'ny 60 % -80% na mihoatra.
2. Ny dingana famindrana sy ny fepetra manokana dia mifanaraka tanteraka amin'ny torolàlana.
3. Aorian'ny famindrana dia azo angonina ao anatin'ny 24-72 ora ny santionany ho an'ny fitiliana mRNA (RT-PCR) na ny fitiliana proteinina ao anatin'ny 48-96 ora (WB)
② fizotry ny fitrandrahana RNA
1. Misoroka ny fandotoana amin'ny alàlan'ny enzyme exogenous.Anisan'izany ny fanaovana saron-tava sy fonon-tanana hentitra;mampiasa toro-hevitra pipette sterilized sy fantsona EP;ny rano ampiasaina amin'ny fanandramana dia tsy maintsy RNase-Free.
2. Manoro hevitra ny hanao indroa araka ny soso-kevitra ao amin'ny kitapo fitrandrahana haingana, izay tena hanatsara ny fahadiovana sy ny vokatra.
3. Tsy tokony hikasika ny tsanganana RNA ny rano maloto.
③ Famaritana ny ARN
Rehefa avy nalaina ny ARN dia azo isaina mivantana amin'ny Nanodrop, ary ny famakiana kely indrindra dia mety ho 10ng/ul.
④Mivadika ny fizotran'ny fandikana
1. Noho ny fahatsapana avo lenta amin'ny RT-qPCR, farafahakeliny 3 parallèle no tokony hatao isaky ny santionany mba hisorohana ny Ct manaraka tsy ho hafa loatra na ny SD ho lehibe loatra amin'ny fanadihadiana statistika.
2. Aza atao mangatsiatsiaka sy mandrehitra imbetsaka ny Mix Master.
3. Ny fantsona / lavaka tsirairay dia tsy maintsy soloina amin'ny tendrony vaovao!Aza mampiasa ny tendron'ny pipette mitovy mba hanampiana santionany!
4. Ny sarimihetsika mipetaka amin'ny takelaka 96-lavaka aorian'ny famenoana ny santionany dia mila hosorina amin'ny takelaka.Ny tsara indrindra dia ny centrifuge alohan'ny hametrahana azy eo amin'ny masinina, mba hahafahan'ny ranon-javatra eo amin'ny rindrin'ny fantsona mikoriana midina sy manala ny bubbles.
⑤Fanadihadiana curve mahazatra
| Tsy misy vanim-potoana fitomboana logaritma | Mety misy fifantohana ambony amin'ny môdely |
| Tsy misy sanda CT | Dingana tsy mety amin'ny famantarana famantarana fluorescent; fanimbana ny primer na probes - ny fahamarinany dia azo tsikaritra amin'ny PAGE electrophoresis; tsy ampy ny lasitra; fahapotehan'ny lasitra - misoroka ny fampidirana loto sy ny fanamainana miverimberina sy ny fanalefahana amin'ny fanomanana santionany; |
| Ct>38 | Low amplification fahombiazana;Ny vokatra PCR dia lava loatra;simba ny singa fanehoan-kevitra isan-karazany |
| Linear amplification curve | Ny probes dia mety ho simba amin'ny ampahany amin'ny alàlan'ny tsingerin'ny fanamainana miverimberina na ny fiposahan'ny hazavana maharitra |
| Ny fahasamihafana amin'ny lavaka dika mitovy dia lehibe indrindra | Tsy miempo tanteraka ny vahaolana amin'ny fanehoan-kevitra na tsy mifangaro ny vahaolana amin'ny fanehoan-kevitra;ny fandroana mafana amin'ny fitaovana PCR dia voaloton'ny akora fluorescent |
2.5 Momba ny fanadihadiana ny angona
Ny famakafakana angon-drakitra momba ny qPCR dia azo zaraina amin'ny quantification relative sy quantification absolute.Ohatra, ny sela ao amin'ny vondrona fitsaboana raha oharina amin'ny sela ao amin'ny vondrona fanaraha-maso,
Impiry ny fiovan'ny mRNA amin'ny fototarazo X, izany dia fanombanana ara-dalàna;ao amin'ny sela maromaro, ny mRNA an'ny fototarazo X
Firy ny isan'ny dika mitovy, izany dia fatiantoka tanteraka.Amin'ny ankapobeny, ny tena fampiasantsika ao amin'ny laboratoara dia ny fomba quantitative.Matetika,ny fomba 2-ΔΔctdia ampiasaina indrindra amin'ny andrana, ka ity fomba ity ihany no haseho amin'ny antsipiriany eto.
Fomba 2-ΔΔct: Ny vokatra azo dia ny fahasamihafana eo amin'ny fanehoana ny fototarazo kendrena ao amin'ny vondrona andrana raha oharina amin'ny fototarazo kendrena ao amin'ny vondrona mpanara-maso.Ilaina ny hanamafisana ny fahombiazan'ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo anatiny dia manakaiky ny 100%, ary ny fiviliana havanana dia tsy tokony hihoatra ny 5%.
Ny fomba kajy dia toy izao manaraka izao:
Δct vondrona fanaraha-maso = ct sandan'ny fototarazo kendrena ao amin'ny vondrona fanaraha-maso - ct sandan'ny fototarazo anatiny ao amin'ny vondrona fanaraha-maso
Δct vondrona andrana = ct sandan'ny fototarazo kendrena ao amin'ny vondrona andrana - ct sandan'ny fototarazo anatiny ao amin'ny vondrona andrana
ΔΔct = Δct vondrona fanandramana-Δct vondrona fanaraha-maso
Farany, kajy ny isan'ny fahasamihafana eo amin'ny haavon'ny fanehoana:
Change Fold=2-ΔΔct (mifanaraka amin'ny fiasa excel dia POWER)
Vokatra mifandraika:
Fotoana fandefasana: May-20-2023
