1. Fahatakarana voalohany
Amin'ity dingana ity dia mila mahatakatra ny foto-kevitra sy ny teny sasany isika, mba hisorohana ny fahadisoana eo anatrehan'ny zokiolona, toy ny:
F: Inona no maha samy hafa ny RT-PCR, qPCR, Real-time PCR, ary ny tena-time RT-PCR?
Valiny: RT-PCR dia PCR transcription mivadika(Reverse transcription PCR, RT-PCR), izay karazana polymerase chain reaction (PCR).Ao amin'ny RT-PCR, ny tadin'ny RNA dia avadika ho ADN mifameno, izay ampiasaina ho modely amin'ny fanamafisana ny ADN amin'ny PCR.
Real-time-PCR sy qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) dia zavatra iray ihany, samy PCR fatran'ny fotoana tena izy, izay midika fa ny tsingerin'ny PCR tsirairay dia manana firaketana an-tsoratra amin'ny fotoana tena izy, noho izany dia azo ahitsy ny famakafakana marina ny isan'ny modely fanombohana.
Na dia toa nohafohezina ho RT-PCR aza ny PCR Real-time (PCR fluorescent quantitative tena izy) sy ny PCR Reverse transcription (PCR mivadika), ny fivoriambe iraisam-pirenena dia: RT-PCR dia manondro manokana ny fandikana mivadika.PCR , PCR tena fotoana dia matetika nohafohezina ho qPCR (quantitative real-time PCR).
Ary RT-PCR (RT-qPCR) amin'ny fotoana tena izy, dia ny PCR transcription mivadika miaraka amin'ny teknolojia quantitative fluorescent.: alaivo aloha ny cDNA (RT) avy amin'ny transcription mivadika RNA, ary avy eo dia ampiasao PCR Real-time ho an'ny famakafakana quantitative (qPCR).Ny ankamaroan'ny laboratoara dia manao RT-qPCR, izany hoe, fikarohana momba ny RNA expression down-regulation, ka ny qPCR izay resahin'ny rehetra ao amin'ny laboratoara dia tena manondro RT-qPCR, saingy aza adino fa mbola betsaka ny fitiliana ADN amin'ny fampiharana klinika.Famakafakana betsaka, toy ny fitiliana ny viriosy hepatita B HBV.
Fanontaniana: Rehefa avy namaky be dia be ny fluorescent quantitative PCR, nahoana no tokony ho fehezina ao anatin'ny 80-300bp ny sombin-javatra amplified?
Valio: Ny halavan'ny filaharan'ny fototarazo tsirairay dia samy hafa, ny sasany dia maromaro kb, ny sasany dia an-jatony bp, fa ny halavan'ny vokatra dia tokony ho 80-300bp ihany rehefa mamolavola primers, fohy loatra na lava loatra dia tsy mety amin'ny fitiliana PCR fluorescent quantitative.Fohy loatra ny sombin'ny vokatra ka tsy azo avahana amin'ny primer-dimer.Ny halavan'ny primer-dimer dia eo amin'ny 30-40bp, ary sarotra ny manavaka na primer-dimer na vokatra raha latsaky ny 80bp.Raha lava loatra ny sombiny vokatra, mihoatra ny 300bp, dia hitarika ho amin'ny fahombiazan'ny amplification ambany ary tsy afaka mamantatra tsara ny habetsaky ny fototarazo.
Ohatra, rehefa manisa ny isan'ny olona ao an-dakilasy ianao dia mila manisa ny isan'ny vava.Toy izany koa rehefa mahita fototarazo ianao, mila mamantatra ny filaharan'ny fototarazo iray ianao mba hanehoana Ny filaharana manontolo dia hanao.Raha te hanisa olona ianao dia mila manisa ny vava sy ny orona, ny sofina ary ny solomaso, ary mora ny manao fahadisoana.
Mba hanitarana, amin'ny fikarohana biolojika, dia misy tranga fikarohana maro isan-karazany, satria ny filaharan'ny fototarazo amin'ny karazana rehetra dia lava be, tsy ilaina ary tsy azo atao ny mandrefy ny sombiny rehetra, toy ny filaharan'ny bakteria 16S, izany hoe manatanteraka ny filaharan'ny bakteria mpandala ny nentin-drazana Assays mba hamaritana ny isan'ny mponina bakteria.
F: Inona ny halavany tsara indrindra ho an'ny famolavolana primer qPCR?
Valio: Amin'ny ankapobeny, ny halavan'ny primer dia eo amin'ny 20-24bp, izay tsara kokoa.Mazava ho azy fa tsy maintsy mandinika ny sandan'ny TM amin'ny primer isika rehefa mamolavola ny primer, satria mifandraika amin'ny mari-pana tsara indrindra izany.Taorian'ny fanandramana maro dia voaporofo fa ny 60 ° C dia sanda TM tsara kokoa.Raha ambany loatra ny mari-pana annealing, dia mety hitarika amin'ny fanamafisana tsy voafaritra.Raha avo loatra ny mari-pana fanalefahana, dia ho ambany ny fahombiazan'ny amplification, hanomboka any aoriana ny tampon'ny curve amplification, ary hahemotra ny sandan'ny CT.
F: Inona no maha samy hafa ny fomba fandokoana amin'ny fomba fanadihadiana?
Valiny: fomba fandokoanaNy lokon'ny fluorescent sasany, toy ny SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, sns., dia tsy mamoaka hazavana ho azy, fa mamoaka fluorescence rehefa mifamatotra amin'ny lavaka kely amin'ny ADN misy tady roa.Noho izany, amin'ny fiandohan'ny fanehoan-kevitra PCR, ny milina dia tsy afaka mahita ny famantarana fluorescent.Rehefa tonga amin'ny dingan'ny fanitarana annealing ny fanehoan-kevitra, dia misokatra ny tady roa, ary misy kofehy vaovao atambatra eo ambanin'ny asan'ny polymerase ADN, ary ny molekiola fluorescent dia mifatotra amin'ny dsDNA minor groove.Rehefa mitombo ny isan'ny tsingerin'ny PCR, dia mihamaro ny loko mitambatra miaraka amin'ny ADN misy tady roa, ary mihamitombo hatrany koa ny famantarana fluorescent.Ny fomba fandokoana dia ampiasaina indrindra amin'ny fikarohana siantifika.
PS: Tandremo rehefa manao andrana fa tsy maintsy ampiarahina amin'ny ADN olombelona ny loko, tandremo tsara ny mamadika azy ho olona fluorescent.
Fomba fandokoana (ankavia) Fomba fikarohana (ankavanana)
PS: Tandremo rehefa manao andrana fa tsy maintsy ampiarahina amin'ny ADN olombelona ny loko, tandremo tsara ny mamadika azy ho olona fluorescent.
SYBR Green Ⅰ dia mifamatotra amin'ny lavaka kely amin'ny ADN
Fomba fikarohanaTaqman probe no probe hydrolysis matetika ampiasaina.Misy vondrona fluorescent eo amin'ny faran'ny 5′ amin'ny probe, matetika FAM, ary ny probe mihitsy dia filaharana mifameno amin'ny fototarazo kendrena.Misy vondrona famonoana fluorescent amin'ny faran'ny 3′.Araka ny fitsipiky ny Fitsipiky ny Firenena Fluorescence (Förster Resonance Energy, Fret), ny vondrona Fluorescent Girler (Donor Fluorescent Molecule) ary tena akaiky ny spectra (7-10nm), ny fiakaran'ny molekiola Tor molekiola, raha malemy kosa ny autofluorescence.Noho izany, amin'ny fiandohan'ny fanehoan-kevitra PCR, rehefa malalaka sy tsy misy dikany ny probe ao amin'ny rafitra, ny vondrona fluorescent mpanao gazety dia tsy hamoaka fluorescence.Rehefa manao annealing, ny primer sy ny probe dia mifatotra amin'ny môdely.Mandritra ny dingana fanitarana, ny polymerase dia mamorona rojo vaovao tsy tapaka.Ny ADN polymerase dia manana hetsika exonuclease 5′-3′.Rehefa tonga any amin'ny probe, ny polymerase ADN dia hi-hydrolyze ny probe avy amin'ny môdely, hanasaraka ny vondrona fluorescent mpanao gazety amin'ny vondrona fluorescent quencher, ary hamoaka ny famantarana fluorescent.Koa satria misy fifandraisana tokana eo amin'ny probe sy ny môdely, ny fomba probe dia ambony noho ny fomba fandokoana raha ny marina sy ny fahatsapana ny fitsapana.Ny fomba fitiliana dia ampiasaina indrindra amin'ny diagnostika.
F: Inona no atao hoe quantification tanteraka?Inona no atao hoe Relative Quantification?
Valio: Ny fanisana tanteraka dia manondro ny kajy ny laharan'ny kopia voalohany amin'ny santionany hozahan'ny qPCR, toy ny isan'ny viriosy HBV ao anatin'ny 1ml ra.Ny vokatra azo amin'ny fampitomboana relatif dia ny fiovan'ny habetsaky ny fototarazo kendrena ao amin'ny santionany manokana mifandraika amin'ny santionany fanondro hafa, ary ny fanehoana ny fototarazo dia miakatra na midina.
F: Misy fiantraikany amin'ny valin'ny fanandramana ve ny habetsahan'ny fitrandrahana RNA, ny fahombiazan'ny fandikana mivadika, ary ny fahombiazan'ny fanamafisana?
F: Hisy fiantraikany amin'ny valin'ny fanandramana ve ny fitahirizana santionany, ny reagents fitrandrahana, ny reagents transcription mivadika, ary ny kojakoja fampitana hazavana?
F: Inona no fomba afaka manitsy ny angona andrana?
Mikasika ireo olana ireo dia holazainay amin'ny antsipiriany ao amin'ny fizarana mandroso sy mandroso eto ambany.
2. Fahalalana ambony
Raha ny momba ny PCR fatran'ny fluorescent tena izy, dia tsy maintsy ekentsika ny zava-misy fa taratasy fikarohana siantifika an'arivony no navoaka isan-taona, anisan'izany ny teknolojia PCR fluorescent quantitative dia tsy vitsy.
Raha tsy misy fenitra mahazatra handrefesana ny fanandramana PCR fluorescent quantitative, dia mety miovaova be ny valiny.Ho an'ny fototarazo mitovy amin'ny karazana mitovy, miaraka amin'ny fomba fanodinana mitovy, dia hiovaova be ihany koa ny valin'ny fitiliana, ary ho sarotra ho an'ireo tara ny hamerina ny vokatra mitovy.Ianao Tsy misy mahalala izay tsara sy ratsy.
Midika ve izany fa ny PCR fluorescent quantitative dia teknolojia fitaka na teknolojia tsy azo ianteherana?Tsia, satria ny PCR fluorescent quantitative dia saro-pady kokoa sy marina kokoa, ary ny fandidiana diso kely dia hiteraka vokatra mifanohitra tanteraka.Arivo kilaometatra miala ny fatiantoka kely.Mety hampijalin'ny mpandinika imbetsaka ny mpanoratra ny lahatsoratra.Amin'izay fotoana izay ihany koa, sarotra ny misafidy amin'ny valin'ny fanandramana samihafa ireo mpandinika ny diary.
Amin'ny ankapobeny, manondro ny tsy fahampian'ny marimaritra iraisana amin'ny andrana PCR tena izy.Noho izany, ny mpahay siansa zokiolona ao amin'ny indostria dia nanomboka namolavola fenitra,mitaky ny mpandray anjara mba hanome antsipiriany ilaina amin'ny fanandramana sy fanodinana angon-drakitra (anisan'izany ny angona ilaina) ao amin'ny lahatsoratra mba hanatratrarana ireo fenitra ireo.
Ny mpandinika dia afaka mitsara ny kalitaon'ny fanandramana amin'ny famakiana ireo antsipiriany ireo;Ireo mpamaky amin'ny ho avy dia afaka mampiasa izany hamerenana ny fanandramana na hanatsara ny fanandramana.Avy eo ny vokatra andrana azo amin'izany fomba izany dia feno fampahalalana, kalitao avo lenta ary azo ampiasaina.
MIBBI (Fampahalalana faran'izay kely ho an'ny fanadihadiana biolojika sy biomedical -http://www.mibbi.org) nipoitra.MIBBI dia tetikasa manome fenitra ho an'ny andrana.Navoaka tamin'ny natiora.Ity tetikasa ity dia mikendry ny fanandramana biolojika isan-karazany, anisan'izany ny biolojia sela, Microarray, qPCR horesahina ankehitriny, sns., ary manome ho an'ny karazana fanandramana tsirairay rehefa mandefa sora-tanana.Izany fampahalalana izany dia tokony omena amin'ny fotoana rehetra.
Ao amin'ny tetikasa MIBBI, misy lahatsoratra roa mifandraika amin'ny PCR quantitative fluorescent, izany hoe:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – fiteny voarafitra sy torolalana momba ny tatitra momba ny angon-drakitra PCR amin'ny fotoana tena izy;
·MIQE (Fampahalalam-baovao faran'izay kely indrindra ho an'ny famoahana ny fanandramana PCR amin'ny fotoana tena izy) - fampahalalana kely indrindra amin'ny famoahana lahatsoratra momba ny fanandramana PCR amin'ny fotoana tena izy.
Voalohany, andao hiresaka momba ny RDML, ny famaritana ny teny.
Raha tsy misy famaritana manara-penitra ho an'ny zava-drehetra dia tsy azo atao ny manohy ny dinika, ka izany no mahatonga ny fanazavana ny teny ho zava-dehibe amin'ny fanadinana.
Ny voambolana ampiasaina amin'ny andrana PCR fluorescent quantitative dia ahitana ireto atiny manaraka ireto.QIAGEN dia nanao famintinana tsara indrindra ho antsika.Maina daholo ireto manaraka iretoENTANA .
Curve fanamafisam-peo
Ny curve amplification dia manondro ny curve natao nandritra ny dingan'ny PCR, miaraka amin'ny laharan'ny tsingerina ho abscissa ary ny hamafin'ny fluorescence amin'ny fotoana tena izy mandritra ny fanehoan-kevitra ho ordinate.
Ny curve amplification tsara dia tokony hanana ireto toetra manaraka ireto: fisaka na nihena kely ny tsipika fototra, ary tsy misy fironana miakatra mibaribary;mazava ny teboka fiodin'ny curve, ary ny fisondrotry ny dingan'ny exponential dia mifandanja amin'ny fahombiazan'ny amplification.Arakaraka ny haben'ny slope, ny avo kokoa ny fahombiazan'ny amplification;ny curve amplification ankapobeny Ny parallelism dia tsara, izay manondro fa ny fahombiazan'ny amplification ny fantsona tsirairay dia mitovy;miharihary ny dingana exponential amin'ny curve amplification amin'ny santionany ambany.
Baseline (baseline)
Ny baseline dia ny haavon'ny tabataba amin'ny tsingerina voalohany, Matetika no refesina eo anelanelan'ny tsingerina faha-3 sy faha-15, satria tsy hita mandritra io vanim-potoana io ny fiakaran'ny sandan'ny fluorescence vokatry ny vokatra fanamafisam-peo.Ny isan'ny tsingerina ampiasaina amin'ny kajy ny tsipika fototra dia mety miovaova ary mety mila ahena raha be dia be ny mari-pamantarana ampiasaina na raha ambony ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo kendrena.
Ny fametrahana ny baseline dia mitaky ny fijerena ny angona fluorescence avy amin'ny curve amplification linearity.Ny tsipika fototra dia napetraka ka ny fitomboan'ny curve fanamafisam-peo dia manomboka amin'ny laharan'ny tsingerina lehibe kokoa noho ny laharana ambony amin'ny tsingerina fototra.Mila apetraka tsirairay ny tsipika fototra ho an'ny filaharana kendrena tsirairay.Ny sandan'ny fluorescence antonony hita tamin'ny tsingerina tany am-boalohany dia mila esorina amin'ny sanda fluorescence azo amin'ny vokatra ampitomboina.Ny dikan-teny farany amin'ny rindrambaiko PCR Real-Time isan-karazany dia mamela ny fanatsarana mandeha ho azy ny firafitry ny baseline ho an'ny santionany tsirairay.
Nandritra ny tsingerina vitsivitsy voalohany amin'ny fanehoan-kevitra fanamafisam-peo PCR dia tsy miova firy ny famantarana ny fluorescence.Ny fanatonana tsipika mahitsy dia antsoina hoe baseline, fa raha mijery akaiky ireo tsingerina vitsivitsy voalohany isika dia hitantsika fa ao anatin'ny tsipika fototra no mitranga amin'ny sary etsy ambany.
Background Background dia manondro
ny sanda fluorescence tsy voafaritra amin'ny fanehoan-kevitra.Ohatra: famonoana fluorescence tsy mahomby;na karazana ADN mitongilana roa be dia be noho ny fampiasana SYBR Green.Ny singa fototra amin'ny famantarana dia esorina amin'ny matematika amin'ny alàlan'ny algorithm rindrambaiko PCR Real-Time.
Famantarana mpanao gazety
Ny mari-pamantarana mpanao gazety dia manondro ny famantarana fluorescent navoakan'ny SYBR Green na ny famandrihana manokana momba ny filaharana misy fluorescently mandritra ny PCR Real-Time.
Signal Reporter Normalized (RN)
Ny RN dia manondro ny hamafin'ny fluorescence amin'ny loko mpanao gazety mizara amin'ny hamafin'ny fluorescence amin'ny loko reference passive refesina isaky ny tsingerina.
Fandokoana reference passive
Amin'ny PCR Real-Time sasany,Ny lokon'ny fluorescent ROX dia ampiasaina ho fanondroana anatiny mba hanamafisana ny famantarana ny fluorescent.Izy io dia manitsy ny fiovaovana noho ny tsy fahampian'ny pipetting, ny toerana tsara ary ny fiovaovan'ny fluorescence amin'ny fototra tsara.
Ny haavon'ny fluorescence (tokona)
dia namboarina teo ambonin'ny sandan'ny lamosina ary teo ambanin'ny sandan'ny lembalemba amin'ny curve fanamafisam-peo.Tsy maintsy mipetraka ao amin'ny faritra tsipika amin'ny curve fanamafisam-peo izy io, izay maneho ny salan'ny log-linear amin'ny fitiliana PCR.Tokony hapetraka ao amin'ny fijery curve fanamafisam-peo ny tokonam-baravarana mba ho mora fantarina ny dingan'ny log-linear an'ny PCR.Raha misy fototarazo kendrena maromaro ao amin'ny PCR Real-Time, dia tsy maintsy apetraka ny tokonana ho an'ny kendrena tsirairay.Amin'ny ankapobeny, ny famantarana fluorescence amin'ny tsingerin'ny PCR 15 voalohany dia ampiasaina ho famantarana ny fluorescence background, ary ny tokonam-baravaran'ny fluorescence dia 10 heny ny fivilian-dàlana mahazatra amin'ny famantarana ny fluorescence amin'ny tsingerin'ny PCR 3 ka hatramin'ny 15 voalohany, ary ny tokonam-baravaran'ny fluorescence dia napetraka ao amin'ny dingana exponential ny PCR amplification.Amin'ny ankapobeny, ny fitaovana tsirairay dia manana ny fetran'ny fluorescence napetraka alohan'ny hampiasana azy.
Tsikelikely tokonam-baravarana (CT) na Crossing Point (CP)
Ny tsingerin'ny fiolahana fanamafisam-peo miampita ny tokonam-baravarana (izany hoe, ny teboka izay mampitombo be ny fahitana ny fluorescence).Ny CT dia mety ho ampahany ary azo kajy ny habetsaky ny môdely fanombohana.Ny sandan'ny CT dia maneho ny isan'ny tsingerina niainana rehefa tonga eo amin'ny tokonam-baravarana napetraka ny famantarana fluorescent ao amin'ny fantsona fanehoan-kevitra PCR tsirairay.Misy fifandraisana tsipika eo amin'ny sandan'ny CT isaky ny môdely sy ny logaritma amin'ny laharana kopia voalohany amin'ny môdely, nyavo kokoa ny laharana kopia voalohany, ny kely kokoa ny sandan'ny CT, ary ny mifamadika amin'izany.Ny curve manara-penitra dia azo atao amin'ny alalan'ny fampiasana ny laharan'ny kopia voalohany fantatra, ka ny abscissa dia maneho ny sanda CT, ary ny ordinate dia maneho ny logaritma amin'ny laharana kopia voalohany.Noho izany, raha mbola azo ny sandan'ny CT amin'ny santionany tsy fantatra, ny laharan'ny kopia voalohany amin'ny santionany dia azo kajy amin'ny curve mahazatra.
ΔCT sanda
ΔCT sanda mamaritrany fahasamihafana misy eo amin'ny fototarazo kendrena sy ny sanda CT mifandraika amin'ny fototarazo endogenous, toy ny fototarazo fitahirizana trano, ary ampiasaina hanamafisana ny habetsaky ny môdely ampiasaina:
⇒ΔCT = CT (gène kendrena) - CT (géné référence endogeous)
ΔΔCT sanda
Ny sandan'ny ΔΔCT dia mamaritra ny fahasamihafana misy eo amin'ny sandan'ny ΔΔCT amin'ny santionan'ny tombontsoa (ohatra, ny sela mihetsiketsika) sy ny sandan'ny ΔΔCT amin'ny santionany reference (ohatra, ny sela tsy mihetsiketsika).Ny santionan'ny fanondroana dia antsoina koa hoe santionan'ny calibration ary ny santionany hafa rehetra dia normalize amin'ity ho an'ny quantification:
⇒ΔΔCT = antonony ΔCT (santionany mahaliana) - antonony ΔCT (santionany fanondro)
Genes reference endogenous
Ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo reference endogenous, toy ny fototarazo fitahirizana trano (genes de housekeeping), dia tsy misy fahasamihafana eo amin'ny santionany.Ny fampitahana ny soatoavin'ny CT amin'ny fototarazo reference amin'ny fototarazo kendrena dia mamela ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo kendrena ho ara-dalàna amin'ny habetsahan'ny RNA na cDNA fampidirana (jereo ny fizarana momba ny soatoavina ΔCT etsy ambony).
Ny fototarazo reference anatiny mety amin'nymety ho fahasimban'ny RNA na ny fisian'ny inhibitors anzima ao amin'ny santionany RNA, ary koa ny fiovaovan'ny votoatin'ny RNA, ny fahombiazan'ny transcription mivadika, ny famerenana ny asidra nokleika, ary ny fikarakarana santionany.Mba hisafidianana ny fototarazo tsara indrindra, dia nanova ny algorithm izahay mba hamela ny fifantenana ny reference tsara indrindra miankina amin'ny toerana andrana.
Fanaraha-maso anatiny
Filaharana fanaraha-maso izay ampitomboina amin'ny fanehoan-kevitra mitovy amin'ny filaharana kendrena ary nozahana amin'ny famotopotorana hafa (izany hoe, fanaovana PCR duplex).Ny fanaraha-maso anatiny dia matetika ampiasaina hanilihana ny fanamafisam-peo tsy nahomby, toy ny rehefa tsy hita ny filaharan'ny tanjona.
Santionany calibration
Santionany fanondroana (ohatra, RNA nodiovina avy amin'ny tsipika na sela) ampiasaina amin'ny famaritana mifandraika amin'ny fampitahana ny santionany hafa rehetra hamaritana ny haavon'ny fanehoana ny fototarazo.Ny santionan'ny calibration dia mety ho santionany rehetra, fa matetika fanaraha-maso (ohatra, santionany tsy voatsabo na santionany amin'ny fotoana aotra amin'ny fanandramana).
Fanaraha-maso tsara
mampiasa fanehoan-kevitra fanaraha-maso amin'nyfantatra ny habetsahan'ny môdely.Ny fanaraha-maso tsara dia matetika ampiasaina mba hanamarinana raha miasa tsara ny seta primer na seta fanadihadihana voalohany ary natsangana tsara ny fanehoan-kevitra.
Tsy misy fanaraha-maso môdely (NTC)
Fihetsika fanaraha-maso izay ahitana ny singa rehetra ilaina amin'ny fanehoan-kevitra fanamafisam-peo afa-tsy ny môdely, izay matetika soloina rano.Ny fampiasana ny NTC dia afaka mahita ny loto ateraky ny fandotoana reagent na ADN vahiny, ka miantoka ny maha-azo itokiana sy ny fahatokisana ny angon-drakitra.Ny fanamafisana ny fanaraha-maso NTC dia manondro fandotoana.
Tsy misy fanaraha-maso RT (NRT)
Ny dingan'ny fitrandrahana RNA dia mety misy ADN génômika sisa tavela, izay tena manimba ary ilay meloka misy fiantraikany amin'ny kalitaon'ny angona sy ny fahavalo voajanahary amin'ny qPCR, ka rehefa mamolavola andrana dia tsy maintsy natao mba hanamafisana ny fitadiavana RNA ihany.Misy fomba roa, ny iray dia ny famolavolana primer manerana ny introns, ny iray hafa dia ny fanesorana tanteraka ny ADN, izay tsara kokoa, izay horesahina any aoriana.Ny fanaraha-maso NTR dia fitaratra majika hamantarana ny fandotoana ADN.Raha misy ny amplification dia midika izany fa misy ny loto.
Fenitra
Ny fenitra dia santionany amin'ny fifantohana fantatra na laharan'ny kopia izay ampiasaina amin'ny fananganana curve mahazatra.Mba hiantohana ny fahamarinan-toeran'ny fenitra, ny sombintsombin'ny fototarazo dia matetika atao clone ao amin'ny plasmid ary ampiasaina ho fenitra.
Ny curve mahazatra
dia matetika no levona ao amin'ny fara fahakeliny 5 gradients fifantohana amin'ny vokatra manara-penitra araka ny avo roa heny ny tahan'ny, ary 5 teboka dia voasarika ao amin'ny fandrindrana ny CT sandan'ny isa sy ny dika mitovy, ary ny teboka dia mifandray mba hamorona tsipika mba hamokatra curve mahazatra.Ho an'ny curve manara-penitra tsirairay dia mila jerena ny fahamarinany.Ny sandan'ny slope dia eo anelanelan'ny -3.3 sy -3.8, ary ny fifantohana tsirairay dia atao amin'ny triplicate.Ireo teboka tsy mitovy amin'ny teboka hafa dia tokony hariana.Ny sandan'ny CT amin'ny santionany hotsapaina dia entina ao amin'ny curve mahazatra, ary azo kajy ny haavon'ny fanehoana ny santionany hotsapaina.
Ny sandan'ny CT amin'ny santionany hotsapaina dia entina ao amin'ny curve mahazatra, ary ny laharan'ny kopia voalohany amin'ny santionany hotsapaina dia azo kajy.
Efficiency sy Slope
Ny fisondrotry ny curve mahazatra dia maneho ny fahombiazan'ny PCR amin'ny fotoana tena izy.
· Ny slope -3.322 dia manondro fa ny fahombiazan'ny PCR amplification dia 1, na 100% mahomby, ary ny habetsahan'ny vokatra PCR dia avo roa heny isaky ny tsingerina.
· Ny fisondrotana latsaky ny –3.322 (oh: –3.8) dia manondro ny fahombiazan'ny PCR
· Ny hantsana lehibe kokoa noho ny –3.322 (oh: –3.0) dia manondro fa ny fahombiazan'ny PCR dia toa mihoatra ny 100%, izay mahagaga, ahoana no ahafahan'ny tsingerin'ny PCR iray miteraka mihoatra ny avo roa heny ny vokatra ampitomboina?Ity toe-javatra ity dia mitranga amin'ny dingana tsy misy tsipika amin'ny fihetsiky ny PCR, izany hoe, misy fanamafisam-peo tsy voafaritra manokana.
curve mitsonika
Rehefa vita ny fanamafisana qPCR dia mafana ny vokatra PCR.Rehefa miakatra ny mari-pana, dia mitsonika tsikelikely ny vokatra fanamafisam-peo misy tady roa, ka mihena ny hamafin'ny fluorescence.Rehefa tratra ny mari-pana (Tm) dia betsaka ny vokatra hiempo.Mihena be ny fluorescence.Ny vokatra PCR samihafa dia manana sanda Tm samihafa sy hafanam-po mitsonika, mba ho fantatra ny maha-tokana ny PCR.
Curve mitsonika (curve derivative)
Ny curve mitsonika dia nalaina mba hamoronana sarintany tampon'isa, izay afaka mampiseho intuitively kokoa ny toe-javatra ny PCR sombiny vokatra.Satria ny mari-pana mitsonika dia ny sandan'ny Tm amin'ny sombintsombin'ny ADN, ny masontsivana sasany izay misy fiantraikany amin'ny sandan'ny Tm amin'ny sombintsombin'ny ADN dia azo tsaraina, toy ny haben'ny sombintsombiny, ny votoatin'ny GC, sns. Amin'ny ankapobeny, araka ny fitsipiky ny famolavolana fototra,Ny halavan'ny vokatra nohamafisina dia eo amin'ny 80-300bp, noho izany dia tokony ho eo anelanelan'ny 80°C sy 90°C ny mari-pana mitsonika.
Interprétation ny curve mitsonika: Raha toa ka miseho eo anelanelan'ny 80°C-90°C ny tampony lehibe indrindra dia midika izany fa tonga lafatra ny PCR quantitative fluorescent;raha toa ka miseho eo anelanelan'ny 80°C-90°C ny tampony lehibe ary misy tampon'isa isan-karazany eo ambanin'ny 80°C, ny dimer primer dia heverina ho fototra.Azonao atao ny manandrana mampitombo ny mari-pana annealing hamahana azy;raha miseho eo anelanelan'ny 80°C-90°C ny tampony lehibe, ary mipoitra indray ny tampon'isa isan-karazany rehefa miakatra ny maripana, dia heverina fa misy fandotoana ADN, ary mila esorina ny ADN amin'ny dingana voalohany amin'ny andrana.
Mazava ho azy fa mbola misy toe-javatra tsy ara-dalàna sasany, izay hopotehina tsirairay etsy ambany.
3. Fahalalana ambony
Mba hanaovana qPCR dia mila miteny MIQE aho,Fampahalalana kely indrindraho an'ny Publication ofhamaroan'isaPCR amin'ny fotoana tena izyFanandramana - ny fampahalalana kely indrindra amin'ny famoahana lahatsoratra momba ny PCR fatran'ny fotoana tena izyandrana .Mba hanatsorana ny fahatakaran'ny tsirairay dia hanatsotra ny votoatiny fototra.
Azonao atao ny mikaroka ny lahatsoratra tany am-boalohany an'ny MIQE amin'ny Internet, ary ny zava-dehibe indrindra dia ny mamaritra nylisitry ny angon-drakitra tokony omena rehefa mamoaka lahatsoratra .
Ny mpandinika dia afaka mitsara ny kalitaon'ny fanandramana amin'ny famakiana ireo antsipiriany ireo;Ny mpamaky ho avy dia afaka mampiasa izany hamerimberina na hanatsara ny fanandramana.
Tsara ny manamarika fa amin'ity lisitra ity dia misy marika E na D ny lanjan'ny lisitra tsirairay.Inona no dikan'izany?E: fampahalalana ilaina (tsy maintsy apetraka);D: fampahalalana ilaina (manome araka izay azo atao).
MIQE (1)—Famolavolana andrana
Maro ny scumbags izay nahavita ny fiarovan-tenany taorian'ny nahavitany ny fianarany diplaoma dia tsy hahay hamolavola andrana tsy miankina, hanokatra ny kahieny ary hanao izay asain'ny mpampianatra ataony.Vokatr'izany dia tsy henjana ny famolavolana andrana, ary nilaza ny sampana mpamoaka lahatsoratra ao amin'ny gazetiboky fa te hamorona an'io sary io sy io sary io izy ireo, ka nanao izany tao anaty haizina.Toy izany no fomba nanaovana ny scumbags!
Manakaiky kokoa ny trano, ny fitsipika voalohany amin'ny fanandramana dia ny mamaritrany hamafin'ny lojika andrana.Ny zava-dehibe indrindra dia ny famolavolana andrana, ary ny zava-dehibe indrindra amin'ny famolavolana andrana dia ny fomba fametrahana ny santionany kendrena, ny santionany fanondroana (fanaraha-maso), ary ny isan'ny famerimberenana, mba hahafahan'ny angon-drakitra andrana azo atao fanondroana, azo ampitahaina ary maharesy lahatra.
Ny santionany kendrenadia manondro ny santionany izay mitaky antsika hamantatra ny fototarazo kendrena aorian'ny fitsaboana iray.Ny santionany referencedia santionany tsy misy fitsaboana, izay matetika antsoina hoe karazana bibidia amin'ny biolojia.
Replika andranadia tena zava-dehibe.Amin'ny ankapobeny dia tsy maintsy mihoatra ny telo ny isan'ny kopia mandresy lahatra.Ilaina ny manavaka ny atao hoe replication biolojika sy ny replication ara-teknika.
Replika biolojika: Ny fanandramana fanamarinana mitovy natao tamin'ny fitaovana samihafa (fotoana, zavamaniry, andiany, takelaka fanehoan-kevitra).
Fandikana biolojika
Andeha horaisintsika ho ohatra ny fitsaboana amin'ny pestisida amin'ny dipoavatra.Tiantsika ny hitifitra famonoana bibikely amin'ireo zavamaniry telo an'ny ABC, avy eo ireo zavamaniry telo an'ny ABC dia replika biolojika telo, ary mitovy ny fanandramana fanamarinana natao tamin'ny fitaovana samihafa.Fa amin'ny maha-andrana azy dia tena ilaina ny fanaraha-maso, mba hahafahantsika manaparitaka ny iray amin'ireo sampan'ny zavamaniry A mba hamorona vondrona andrana amin'ny zavamaniry A, fa tsy manipy ireo sampana hafa amin'ny zavamaniry A mba hamorona vondrona mpanara-maso.Ataovy toy izany koa ny B sy C.
Replika ara-teknika (Replika ara-teknika): Fanandramana miverimberina natao hialana amin'ny lesoka ateraky ny fampandehanana, izay lavaka dika mitovy tafiditra ao anatin'ny fitaovana iray ihany.Ny fitsaboana sy ny fanaraha-maso dia tsy maintsy manana toe-javatra mitovitovy (telo farafahakeliny) amin'ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo anatiny.
Famerenana ara-teknika
Raiso ho ohatra indray ny poivre tsaboina amin'ny pestiside.Ho an'ny vondrona andrana amin'ny zavamaniry A, dia nanao lavaka PCR telo tamin'ny 1, 2, ary 3 izahay ho an'ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo anatiny, mba haka ny salan'isa aorian'ny fizahana.Ho an'ny fanaraha-maso ny zava-maniry A ny Vondrona koa dia raisina amin'ny fomba mitovy.Toy izany koa, manaova fitsaboana mitovy amin'ny zavamaniry B sy C.Izany dia famerimberenana ara-teknika.
Tsara ny manamarika izanyNy miditra amin'ny statistika dia ny repetition biolojika, ary ny repetition teknika dia ny hitsapana raha misy trangan-javatra kisendrasendra ao anatin'ny dingana andrana, mba hahatonga ny voka-panadinana ho azo itokisana, izany hoe hialana amin'ny fahadisoana amin'ny alàlan'ny fakana ny salan'isa araka ny lazaintsika matetika.
Fanaraha-maso ratsy—NTC sy NRT
NTC (Tsy misy template), fanaraha-maso tsy misy môdely, dia ampiasaina hanamarinana raha voaloto ny akora andrana.Amin'ny ankapobeny, ny rano dia ampiasaina ho modely.Raha misy fanehoan-kevitra fluorescent, dia manondro fa nisy ny fandotoana asidra nokleika tao amin'ny laboratoara.
Ireo loto ireo dia avy amin'ny: rano maloto, reagents tsy manara-penitra misy ADN endogenous, loto voalohany, loton'ny fitaovana laboratoara, loto aerosol, sns., Mila mampiasa scavengers RNase sy inhibitors RNase.Ny fandotoana aerosol no sarotra indrindra hitadiavana.Alao sary an-tsaina hoe toy ny setroka ny laboratoara misy anao, misy asidra nokleika isan-karazany mihantona eny amin'ny rivotra.
NRT (No-Reverse Transcriptase), ny fanaraha-maso tsy misy fandikana mivadika, dia ny RNA tsy mivadika ho toy ny fanaraha-maso ratsy, izay ny fifehezana ny sisa tavela amin'ny gDNA.
Rehefa manao fanehoana ny fototarazo, dia hita ny habetsahan'ny ARN amin'ny alàlan'ny fahitana ny habetsaky ny cDNA aorian'ny fandikana mivadika.Raha misy sisa tavela amin'ny gDNA rehefa diovina ny ARN, dia hiteraka hadisoana amin'ny valin'ny fanandramana izany, satria ny tena vokatra azo dia gDNA sy cDNA.Amin'ny ambaratonga mitambatra, tsy ny cDNA ihany, ny gDNA dia mila esorina tanteraka mandritra ny fitrandrahana RNA.
MIQE (2)—fampahalalana santionany
Ny antsoina hoe fampahalalam-baovao santionany dia midika fa rehefa mamoaka lahatsoratra momba ny qPCR isika dia tsy maintsy manazava mazava tsara ny fampahalalana santionany, izay ampahany tena ilaina amin'ny lahatsoratra.Toy izany koa, rehefa manao santionany isika, dia tsy maintsy manara-maso ny asantsika ihany koa mba hahazoana antoka ny maha-ara-dalàna ny santionany.
Ny famaritana ny santionany dia vokatra ihany, ary tokony handinika bebe kokoa ny fitaovana nalaina nandritra ny fanandramana iray manontolo.
Fifantenana fitaovana andrana
Santionan'ny ra - misafidy ra vaovao, tsy mihoatra ny 4 ora.Santionany sela - misafidy ny hanangona sela vaovao ao anatin'ny vanim-potoanan'ny fitomboana mahery.Animal Tissue—Misafidiana tavy vao misondrotra mafy.Tissue Plant - Mifidiana tavy vaovao sy tanora.
Voamarikao angamba fa misy teny fototra ao anatin'ireto fehezanteny vitsivitsy ireto: fresh .
Ho an'ireo santionany etsy ambony, ny kitapo tsara indrindra, mora vidy ary maharitra eny an-tsena dia ny kitapo Foregene, izay afaka manala haingana sy mora ny ADN sy RNA.
Kitapo fitokana-monina RNA Total Cell
Animal Total RNA Isolation Kit
Fitaovana fitokana-monina RNA Total
Kit Isolation RNA Total Plant Plus
Fitehirizana fitaovana andrana
Amin'ny ankapobeny, tsy manoro hevitra ny fitehirizana santionany izahay, raha mamela ny fepetra.Na izany aza, maro ireo namana tsy afaka manao andrana avy hatrany aorian'ny fakana santionany, ary ny sasany aza dia mila mitondra fiara mifono vy azota eny an-tsaha hanaovana santionany.
Ho an'ity karazana namana miasa mafy ity dia azoko lazaina fotsiny fa tsy azonao ny reagent consumables.Amin'izao fotoana izao, orinasa maro azo ampiasaina amin'ny reagent no mamokatra reagents izay afaka mitahiry santionany RNA amin'ny mari-pana amin'ny efitrano, ary azonao atao ny misafidy ny hampiasa azy ireo.Ny fomba fitehirizana mahazatra dia fitehirizana azota ranon-javatra, amin'ny fampiasana tanky azota azota kely izay mora entina.Rehefa avy naverina tany amin'ny laboratoara ilay santionany dia tehirizo ao anaty vata fampangatsiahana -80°C.
Ho an'ny fanandramana momba ny ARN dia tsy maintsy arahina ny fitsipiky ny teny enina:hafanana ambany, tsy misy enzymes,SYfifadian-kanina .
Ny foto-kevitra momba ny mari-pana ambany dia mora azo;raha tsy misy enzymes, ny RNase dia manerana izao tontolo izao iainantsika (raha tsy izany dia ho matin'ny VIH ianao), koa ny fomba hisorohana ny RNase rehefa manao andrana dia foto-kevitra tena manan-danja;haingana,Tsy misy Kung Fu eto amin'izao tontolo izao izay tsy ho tapaka, fa ny hafainganam-pandeha ihany no tsy mety tapaka.
Noho izany, amin'ny lafiny iray, ny fohy kokoa ny fotoana fitrandrahana, ny tsara kokoa ny kitapo.Nahoana noForegeneNy kitapo dia manantitrantitra ny hafainganam-pandeha, satria fantany tsara izany.
PS: Ny ankizivavy sasany dia manao fanandramana tsara, saingy tsy dia tsara toy ny slam dunk izy ireo taorian'ny taona maro niasana.Mihevitra izy ireo fa tsy rariny Andriamanitra, mitaraina momba ny hafa ary mitady ny fiainana.Raha ny marina, tsy azony ilay izy.Tsy niaro tsara ny RNA izy, ary navitrika ilay mpilalao slam dunk.Rehefa nanao andrana izy dia nihevitra fa hahavita ny slam dunk in-telo sy in-dimy ary fizarana roa, saingy vitany tsara ilay andrana.
Fanamarihana: Miadana kokoa, betsaka kokoa ny mety hisian'ny fanafihan'ny RNase.Ahoana no hampiofanana ny tenanao ho haingana?Tsy misy fomba fa manao fanazaran-tena bebe kokoa.
Ho an'ny fanandramana samihafa sy ny santionany samihafa, dia mbola ilaina ny mamaky literatiora bebe kokoa ary misafidy fomba mety amin'ny fanodinana.Ho an'ny fizotry ny fanangonana sy fitahirizana santionany, ny MIQE dia mitaky fa tsy maintsy soratana mazava tsara ao amin'ny taratasy izany, mba hahafahan'ny mpandinika mijery ny maha-azo itokiana ilay taratasy, ary mety ho an'ireo tanora torana ihany koa ny mamerina ny fanandramanao.
Na dia sarotra aza ny fanandramana biolojika, dia avo lenta izy ireo.Raha tsy mitandrina ianao dia afaka manodina izao tontolo izao.Ohatra, ny fanaovana ny SARS ho krizy biochemika, na ny fanaovana vary hybrid mba hamonjena olona 1,3 miliara.Ny sary eto ambany dia fanandramana simika, tokony ho azonao ny ireharehanao amin'ny fikarohana ataonao amin'ny fijerena fotsiny ny bikany toy ny dick.Adino izany fa aza mainty izy.
MIQE (3) - fitrandrahana asidra nukleika.
Ny fitrandrahana asidra nokleika dia hetsika lehibe, ary ny fanandramana biolojia molekiola rehetra dia manomboka amin'ny fitrandrahana asidra nokleika.Voalohany indrindra, andao handika ny votoatin'ny MIQE momba ny fitrandrahana asidra nokleika.
Raha mijery an'io endrika io ianao dia tsy afaka mijanona eny ambony.Ny endrika dia dogma.Mba ho mpianatra ambony dia tsy maintsy manontany ny antony ianao.Ny votoaty tena ilaina amin'ity latabatra ity dia ny: Manenjikany fahadiovana, ny fahamendrehana, ny tsy fitoviana ary ny habetsahan'ny RNA .
Ny ampahany voalohany amin'nyNy dingana na ny fitaovana dia ny dingana fitrandrahana asidra nukleika.Raha mampiasa mpanangona asidra nokleika mandeha ho azy ianao hanesorana (milaza, azafady mba mifandraisa amiko raha hividy), dia mila manondro ny anaran'ny maodely ny fitaovana ianao.
Ny anaran'ny kitapo sy
inona ny kitapo nampiasaina tamin'ny antsipirian'ny fanovana, inona ny reagents manokana nampiana na ny asa manokana natao dia tokony hazavaina mazava tsara mba hahafahan'ny hafa mamerina mora foana ny fanandramanao.
Ny olona sasany dia manampy reagents manokana rehefa maka santionany manokana, mihevitra fa fiadiana miafina izany ary tsy milaza amin'ny hafa.Na dia mitazona izany ho tsiambaratelo aza izy ireo dia very ny fahafahana hampamirapiratra ny lahatsoratrao.Aza marani-tsaina fa tsy maintsy marin-toetra kokoa noho ny firenena Zhang taloha ianao amin'ny fikarohana siantifika, raha te ho hendry ianao dia ho adala ny lahatsoratra.
tsy maintsy mahatsiaro ny vokatra laharan'ny kitaporehefa manafatra ny kitapo ianao ary manoratra ny lahatsoratra.Amin'ny ankapobeny dia misy isa roa ao amin'ny kitapo: Saka—laharan'ny katalaogy (laharan'ny vokatra, laharan'ny lahatsoratra), Lot—laharan'ny vokatra (Ampiasaina hanondroana ny andiany niavian'ilay vokatra).
Fanampin'izany, ny laharan'ny CAS dia matetika ampiasaina rehefa manafatra reagents biochemika, ary hiara-malaza izany aho.Ny laharan'ny CAS dia ny isa nomen'ny American Chemical Society ho an'ny fanafody simika vaovao tsirairay.Amin'ny ankapobeny, isa telo no ampifandraisina amin'ny tsipika iray.Ny laharana CAS an'i Rushui: 7732-18-5.Ny simika matetika dia manana solon'anarana maro, fa ny laharan'ny CAS dia miavaka.Rehefa manafatra fanafody dia azonao jerena aloha ny laharan'ny CAS.
Akaiky kokoa ny trano, nahoana isika no tsy maintsy mamaritra mazava tsara ireo zavatra ireo?Raha ny marina, izany koa dia ny manamarina ny kalitaon'ny fitrandrahana RNA.Ny fampiasana fitaovana sy fitaovana dia hahatonga ny fitrandrahana RNA tsy miovaova.Ny haavon'ny fitrandrahana ny laboratoara tsotra dia tsy lehibe, ary azo alaina amin'ny fitaovana.
Ny antsipiriany momba ny fitsaboana DNase na RNase
Ny olana manan-danja amin'ny PCR fluorescent quantitative dia ny fisorohana ny fandotoana ADN, ary aza manandrana raha misy loto.Noho izany, ilaina ny milaza ny dingana nampiasainao tamin'ny fanodinana ny ADN, mba hampisehoana fa ny ADN ao amin'ny dingana andrana dia nesorina tanteraka sy tanteraka.aseho amin'ny kisary schematic.
Diagram schematic ny ARN sy ny ADN
Amin'ny ankapobeny, ny fomba hanesorana ny ADN dia ny fitsaboana ny ARN miaraka amin'ny DNase aorian'ny fitrandrahana.Na izany aza, fomba efa tranainy ireo.Ny kitapo fitrandrahana RNA ara-barotra dia afaka nanala ADN nandritra ny dingan'ny fitrandrahana nefa tsy nampiana DNase.Ohatra, kitapo maromaro avy amin'ny Foregene .
Fanamarihana: Ny fanesorana ADN mandritra ny fitrandrahana RNA dia sabatra roa lela tena mampidi-doza, izay hanalava ny fotoana fiasan'ny fitrandrahana RNA ary hampitombo ny mety hisian'ny fahasimban'ny RNA.Amin'ny ankapobeny dia fifampiraharahana eo amin'ny vokatra RNA sy ny fahadiovana.
Ankoatra izany, ny habetsahan'ny DNase ampiana amin'ny tsanganana adsorption mifototra amin'ny silica dia tena kely, ary ny DNase avo lenta dia tsy maintsy ampiasaina mba hahatratrarana ny vokatra.Tsy azo levonina haingana sy tanteraka ny DNase tsy voafehy.Ity dia fitsapana ny haavon'ny teknikan'ny mpivarotra.Mazava ho azy fa misy mpivarotra hafahafa kokoa izay mirehareha fa azo esorina tsy misy DNase ny ADN.Azo lazaina fa hooligan daholo izay mirehareha fa azo esorina tanteraka ny ADN raha tsy misy DNase.Ny ADN dia rafitra misy tady roa tonta, ary tsy ho voafafa amin'ny resaka sy fihomehezana fotsiny.
Fanombanana ny loto
fomba fanombanana: electrophoresis detection, 1% agarose, 6V/cm, 15min, loading 1-3 ul
Famakafakana quantitative asidra nucleic
Matetika no refesina amin'ny alàlan'ny spektrofotometre UV.Mamelà ahy aloha hampalaza ny dikan'ireo soatoavina telo OD260, OD280, ary OD230.
·OD260nm: Ny halavan'ny onjam-pandrefesana amin'ny tampon'ny assorption ambony indrindra amin'ny asidra nokleika, ary ny sanda voarefy tsara indrindra dia avy amin'ny 0.1 ka hatramin'ny 1.0.Raha tsy izany, levona na afangaro ny santionany mba hitondra azy ao anatin'ny elanelana.
·OD280nm: Izy io dia ny halavan'ny onjam-pandrefesana amin'ny tendrony avo indrindra amin'ny proteinina sy ny phenolic.
·OD230nm: Io no halavan'ny onjam-pandrefesana amin'ny tampon'ny gliosida avo indrindra.
Manaraka, andao hiresaka momba ny andraikitry ny tondro tsirairay.Ho an'ny A260, dia azo ampiasaina handrefesana ny fatran'ny asidra nokleika.Rehefa OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Ho an'ny fahadiovana dia mila mijery ny ratio izay hitantsika matetika: OD260/280 sy OD260/230.
· ADN madio: OD260/280 dia mitovy amin'ny 1.8.Rehefa lehibe noho ny 1.9 izany dia manondro fa misy ny fandotoana ARN, ary rehefa latsaky ny 1.6 izany dia manondro fa misy ny fandotoana proteinina sy phenol.
· ARN madio: 1.7
·OD260/230: Na ADN io na RNA, ny sandan'ny fanondroana dia 2.5.Rehefa latsaky ny 2.0 izany dia manondro fa misy ny fandotoana ny siramamy, sira ary zavatra organika.
RNA tsy mivadika
Tena zava-dehibe ny fandrefesana ny fahamendrehan'ny ARN.Amin'ny ankapobeny dia ilaina ny manao fanandramana gel denaturation RNA mba hanamarinana raha fifandraisana roa ny famirapiratry ny 28S sy 18S RNA.Rehefa miseho ny tarika fahatelo 5S dia midika izany fa nanomboka niharatsy ny ARN, afa-tsy ny tsy misy hazon-damosina.
Data ho an'ny fanombanana ny kalitaon'ny RNA: Ho fanampin'ireo fitsapana etsy ambony, dia misy ihany koa ny fitsapana fitaovana mandroso kokoa amin'ny resaka fahamarinan'ny RNA, toy ny fitsapana ny fahamendrehan'ny RQI amin'ny rafitra electrophoresis mandeha ho azy Experion, izay afaka mamantatra raha miharatsy tsy hita maso ny RNA.
Amin'ny fikarohana siantifika, ny PCR quantitative fluorescent dia fampitahana ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo anatiny.Noho izany, amin'ny dingan'ny fitehirizana santionany RNA, fitrandrahana RNA, sns., Ny tanjona voalohany dia ny hiantohana ny fahamendrehan'ny RNA.
Ny fiantraikan'ny fahamarinan'ny ARN amin'ny fifandanjana eo amin'ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo anatiny dia azo takarina mora foana amin'ny sary etsy ambany.Ny fanimbana dia hitarika amin'ny tsy fahatanterahan'ny fototarazo, na ny tsy fahafenoan'ny fototarazo anatiny na ny tsy fahafenoan'ny fototarazo kendrena, dia hisy fiantraikany lehibe amin'ny angon-drakitra izany.
Tsy tokony ho marina ny kisary schematic momba ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo
Fitsapana faneriterena (raha voasakana ny sandan'ny CT amin'ny fifantohana ambony na ambany na fepetra hafa)
Raha raisina ho ohatra ity tarehimarika ity dia toy izao manaraka izao ny sandan'ny Ct amin'ireo curve dimy.Ny fizarana ny soatoavin'ny CT eo anelanelan'ny curve dia tsy mitovy, ary ny sanda Ct dia tara amin'ny fifantohana avo sy ambany, izay trangan'ny fanakanana PCR.
Hevi-dehibe: Ao anatin'ny dingan'ny fitrandrahana RNA dia mila miala amin'ny hevi-diso isika ary mametraka izay marina.
Ny hevi-diso dia ny hoe: ny fitrandrahana RNA dia mikatsaka ny vokatra ihany, mihevitra fa ny habetsahan'ny ARN azo no tsara kokoa.Raha ny marina, rehefa manao quantification isika, raha tsy dia be loatra ny isan'ny fototarazo dia tsy mila RNA loatra isika.Ny habetsahan'ny RNA alainao dia mihoatra noho ny ampy.
Ny hevitra marina dia:Ny fitrandrahana RNA dia tokony hikatsaka fahadiovana, fahamendrehana ary tsy miovaova.Ny fahadiovana dia afaka miantoka fa tsy voasakana ny fandikana mivadika manaraka ary tsy hisy fiantraikany amin'ny ADN ny angon-drakitra.Ny fahamendrehana dia miantoka ny fifandanjana amin'ny filaharana kendrena sy ny fanondroana anatiny.Ny tsy fitoviana dia miantoka ny fametrahana santionany maharitra.
MIQE (4) - transcription mivadika
Hevi-diso: fikatsahana ny habetsahan'ny santionany ambony kokoa.
Hevitra marina: Miezaha tsy miovaova (fahamarinana), na inona na inona habetsahan'ny RNA entina, ny fahombiazan'ny transcription mivadika dia mijanona ho tsy miova, mba hahazoana antoka fa ny fahasamihafana amin'ny cDNA dia afaka maneho marina ny fahasamihafana amin'ny mRNA.
Manazava ity dingana ity amin'ny diagrama schematic izahay:
Diagram schematic momba ny fahombiazan'ny fandikana mivadika, tsy marina
Voalohany indrindra, mila mahatakatra ny fahasamihafana misy eo amin'ny fizotry ny fandikana mivadika sy ny fizotry ny PCR isika.PCR mandalo fanafanana sy annealing dingana maro, ary ny lasibatra kendrena mitombo exponentially;raha tsy manana an'io dingana io ny fandikana mivadika, dia azontsika an-tsaina fa ny fandikana mivadika dia tena iray amin'ny iray mandritra ny dingan'ny replication, toy ny ampahany amin'ny RNA.
satria misy afaka mahazo vaovao cDNA betsaka, dia tokony ho takatra izany amin'izao fotoana izao, satria ny sombintsombiny lehibe sy kely dia nadika mivadika, ary tsy azo atao ny mifantoka amin'ny sombiny iray.Ary satria kely ny habetsahan'ny ARN, dia kely ihany koa ny habetsahan'ny cDNA azo, fa tsy toy ny PCR, izay misy fiantraikany amin'ny fanamafisam-peo, noho izany dia tsy azo fantarina izany.
Ny vokatry ny electrophoresis cDNA
Faharoa, ny tsara indrindra, ny transcription mivadika dia atao tsirairay, saingy tsy misy transcriptase mivadika avy amin'ny orinasa rehetra afaka hahatratra izany vokatra izany.Amin'ny ankapobeny, ny fahombiazan'ny ankamaroan'ny transcriptases mivadika dia mandeha eo anelanelan'ny 30-50%.Raha izany no izy, dia aleontsika manana fahaiza-manao transcription mivadika somary marin-toerana, izay no tiantsika ho hita eo amin'ny sary: 3 RNAs mahazo 2 cDNAs, 6 RNAs mahazo 4 cDNAs, ka na manao ahoana na manao ahoana santionany entana , ny reverse transcription fahombiazana dia somary stable.Tsy tiantsika ny hahita ny toe-javatra izay tsy milamina ny fahombiazan'ny fandikana mivadika ary voasakana ny fifantohana avo.
Noho izany, ahoana no hanamarina raha milamina ny fahombiazan'ny transcription mivadika?Ny fomba dia tena tsotra, ianao ihany no mila manao fampitahana fitsapana: ny iray dia ny mamadika transcribe ao amin`ny cDNA aorian`ny avo roa heny dilution ny ARN, ary ny iray hafa dia ny manao dilution avo roa heny rehefa avy navadika ho cDNA, ary avy eo manao qPCR mba hahitana ny slope azo Mifanaraka.Amin'ny maha-mpianatra ambony anao dia tokony ho azonao izany ao anatin'ny segondra.Araka ny aseho eto ambany:
Ny dilution ny RNA sy ny cDNA mba hitsapana raha milamina ny fahombiazan'ny transcription mivadika
Reverse transcriptase sy kit
Ahoana no ahafahan'ny PCR quantitative fluorescent tonga lafatra manana transcriptase mivadika tsara sy kitapo.Reverse transcriptase dia mizara ho karazany roa araka ny loharano, AMV naM-MLV, ary ny zava-bitany dia mitovy amin'ny hita eo amin'ny latabatra.
RNase H hetsika
Ny RNase H dia Ribonuclease H, ny anarana sinoa dia ribonuclease H, izay endoribonuclease izay afaka manodina manokana ny ARN ao amin'ny rojo hybrid ADN-RNA.Ny RNase H dia tsy afaka mandevona ny fatorana phosphodiester amin'ny ADN na RNA tokana na roa, izany hoe, tsy afaka mandevona ADN na ARN tokana na roa.Matetika ampiasaina amin'ny synthesis ny tady faharoa ny cDNA.
Zavatra hafahafa izany.Lazainay fa ny transcriptase mivadika dia manana hetsika RNase H, fa tsy hoe ny transcriptase mivadika dia misy RNase H, ary mety tsy azo atao ny manasaraka ny RNase H amin'ny transcriptase mivadika, angamba noho ny fampifanarahana ny vondrona sasany amin'ny transcriptase mivadika.
Noho izany, na inona na inona ny fahombiazan'ny transcription ambony kokoa amin'ny AMV, ny hetsika RNase H dia mampihena ny vokatra cDNA.Mazava ho azy, ny mpanamboatra reagent dia manatsara hatrany ny vokatra mba hanafoanana ny hetsika RNase H amin'ny transcriptase mivadika araka izay azo atao mba hampitomboana ny vokatra cDNA.
Mafana ny mari-pana
Firafitry ny ARN faharoa amin'ny hafanana samihafa
Jereo ny sary etsy ambony momba ny firafitry ny RNA faharoa amin'ny mari-pana samihafa, ary ampiasao ny fitaovana an-tserasera mFold hamaritana ny rafitra faharoa amin'ny sombintsombiny kendrena ao anatin'ny mari-pana manokana sy ny toe-piainan'ny sira.Ao amin'ny 55 ° C, ny rafitra faharoa amin'ny RNA dia mbola tena sarotra, ny transcriptase mivadika dia tsy afaka miasa, ary ny rafitra faharoa dia tsy ho voavaha tanteraka raha tsy amin'ny 65 ° C, raha ny mari-pana tsara indrindra amin'ny AMV sy M-MLV dia ambany lavitra noho io mari-pana io.
ny hatao?Ny rafitra faharoa dia ny fampifangaroana ny môdely mihitsy, izay mitarika amin'ny fifaninanana matanjaka eo amin'ny primer sy ny transcriptase mivadika ary ny môdely, ka miteraka olana maromaro toy ny ambany E sy ny tsy fahampian'ny famerenana.
ny hatao?Ampitomboy araka izay azo atao ihany ny mari-pana fanalana .
Mpanamboatra reagent maro no manatsara ny transcriptase mivadika amin'ny alàlan'ny injeniera fototarazo.Ny sasany dia mampitombo ny hafanan'ny fanehoan-kevitra, toy ny Jifan sy Aidelai, ary ny sasany dia manala ny vondrona mavitrika amin'ny enzyme RNase H mba hanatsarana ny fifandraisana misy eo amin'ny anzima sy ny môdely RNA.Ny fifandraisana ambony dia afaka manindry ny rafitra faharoa ary mamaky tsara, ary manatsara ny fahombiazan'ny fandikana mivadika.
Hevi-dehibe: Ny transcription mivadika dia zava-dehibe kokoa mba hikatsahana ny tsy fitoviana amin'ny fahombiazan'ny transcription mivadika (tsy tokony ho mahomby ihany ny enzymes fa azo antoka ihany koa), fa tsy ny habetsaky ny santionany entina, raha tsy PCR quantitative fluorescent lehibe indrindra, dia tsy ho azo atao mihitsy izany.CDNA maro.
Nanao ezaka ihany koa ny mpanamboatra isan-karazany amin'ny fikatsahana ny tsy fitoviana.Ohatra, ny ankamaroan'ny orinasa dia efa nametraka transcription mivadika ho kitapo mahazatra amidy, izay safidy tsara.
Ohatra, ny kitapo RT Easy Series an'ny Foregene:
RT Easy I (Master premix ho an'ny kitapo synthesis cDNA voalohany)
MIQE (5) - fampahalalana momba ny fototarazo
Manazava ny sary etsy ambony
1. Azo hamarinina amin'ny andrana miverimberina na mahomby amin'ny andrana miverimberina io fototarazo io.
2. Gene ID, fantatrao.
3. Ny halavan'ny fototarazo, ny halavan'ny totalin'ny fototarazo kendrena dia tsy misy olana.Rehefa mamolavola primers, ho azo antoka fa ny halavan'ny amplicon dia eo anelanelan'ny 80-200bp mba hiantohana ny fahombiazan'ny amplification tsara kokoa.
4. Sequence Blast fampitahana fampahalalana, ny fototarazo kendrena dia mila ampitahaina amin'ny genebank mba hisorohana ny tsy fanamafisana manokana.
5. Ny fisian'ny pseudogenes.Ny pseudogene dia filaharan'ny ADN mitovy amin'ny fototarazo mahazatra saingy very ny asany mahazatra.Matetika izy io no misy ao amin'ny fianakavian'ny eukaryotes marobe.Matetika izy io no aseho amin'ny ψ.Izy io dia dika mitovy amin'ny ADN génomika tsy miasa ao amin'ny génome izay tena mitovy amin'ny filaharan'ny fototarazo., dia tsy voadika amin'ny ankapobeny, ary tsy misy dikany ara-batana mazava.
6. Ny toeran'ny primer raha oharina amin'ny exon sy introns.Tany am-piandohana, rehefa namaha ny olan'ny fandotoana ADN izahay, dia matetika no nifantoka tamin'ny toeran'ny primers, exons, ary introns, ary amin'ny ankapobeny dia nihevitra ny famolavolana primers manerana ny intron izahay mba hialana amin'ny fanamafisana ny ADN.Azafady, jereo ny sary eto ambany: ny mainty dia maneho ny intron, ny manga isan-karazany dia maneho ny exon, ny mavokely dia maneho ny primer mahazatra, ary ny mena mamiratra dia maneho ny primer-spanning intron.
Schematic, tsy marina
Tena drafitra tonga lafatra izany, fa raha ny marina, amin'ny ankamaroan'ny tranga, ny primer trans-intron dia tsy mahagaga araka ny eritreretina, ary hiteraka fanamafisam-peo tsy voafaritra.Koa ny fomba tsara indrindra hisorohana ny fandotoana ADN dia ny fanesorana tanteraka ny ADN.
7. Faminanian'ny conformation.Amin'ny fampiasana an'ity ohatra ity indray, ampiasao ny fitaovana an-tserasera mFold hamaritana ny rafitra faharoa amin'ny sombintsombiny kendrena amin'ny mari-pana manokana sy fifantohana sira.
Firafitry ny ARN faharoa amin'ny hafanana samihafa
Ny rafitra faharoa dia ny fampiraisana mifameno amin'ny môdely mihitsy, izay hitarika amin'ny fifaninanana matanjaka eo amin'ny fanambadian'ny primer sy ny môdely, ary kely kokoa ny mety hisian'ny fifamatorana voalohany, ka miteraka olana maromaro toy ny ambany E sy ny tsy fahampian'ny famerenana.Amin'ny alàlan'ny vinavinan'ny rindrambaiko, raha tsy misy olana ara-drafitra faharoa, dia tsara izany.Raha misy, ny lahatsoratra manaraka dia hiresaka manokana ny fomba hamahana ity olana ity.
MIQE (6)—qPCR Oligonucleotides
Ho an'ny PCR fluorescent quantitative, ny zavatra voalohany atrehinao isan'andro dia ny fitrandrahana RNA, ary ny zavatra faharoa dia ny famolavolana primer.
Voalohany indrindra, mbola manamarina ny fitsipika momba ny famolavolana primer isika araka ny lisitry ny fanamarinana MIQE.Tsotra be izany ka afaka mihomehy ny scumbags, ary afaka mamarana azy amin'ny fehezanteny iray isika: fantaro ny filaharan'ny probe voalohany sy ny fomba fanovana.Ho an'ny fomba fanadiovana voalohany, ny synthesis primer dia mora amin'izao fotoana izao, ny qPCR dia mendrika ny PAGE sy ny fomba fanadiovana ambony, ary ny fampahalalana momba ny fitaovana synthesis dia tsy zava-dehibe.Olona maro no nanao primer nandritra ny am-polony taona maro ary tsy mahafantatra fa ny synthesizer dia ABI3900.
Mikasika ny foto-kevitry ny famolavolana primer dia tsy mila mitadidy azy ireo amin'ny fitadidiana ianao, satria ny ankamaroan'ny rindrambaiko famolavolana primer na fitaovana an-tserasera dia afaka miatrika ireo olana ireo (fitaovana an-tserasera primer3.ut.ee/) ary ny 99,999% amin'ny famolavolana primer dia tsy atao amin'ny tanana.
Jereo fotsiny ireto teboka manaraka ireto aorian'ny famolavolana ny primers:
1. Famolavolana primers akaikin'ny 3′ fiafarana: Raha ny fampiasana oligo dT primers ho an'ny cDNA voalohany-strand synthesis, raha jerena ny reverse transcription fahombiazana sy ny RNA tsy fivadihana, ireo primers natao dia tokony ho natao akaiky ny 3′ fiafarana mba hanatsarana ny amplification fahombiazana.Mampiasà sary hanazavana toy izao manaraka izao (tsy misy fomba hahazoana izany):
Nahoana ny primer no tokony hamboarina manakaiky ny 3′ fiafarana, tsy tokony ho marina izany
2. Sanda TM: Ny sanda Tm dia amin'ny 55-65 ° C (satria ny hetsika exonuclease no ambony indrindra amin'ny 60 ° C), ary ny votoatin'ny GC dia eo amin'ny 40% -60%.
3. BLAST: Mba hisorohana ny fanamafisam-peo tsy voafaritra manokana amin'ny génome, ny Blast dia tsy maintsy ampiasaina amin'ny fanamarinana fanampiny.
MIQE(7)—fizotry ny qPCR
1. kitapo qPCR
Araka ny fepetra takian'ny MIQE, dia tsy maintsy mamaritra mazava tsara ny fepetra fanehoan-kevitra feno ao amin'ny lahatsoratra, ao anatin'izany ny fanamafisana ny rafitra fanehoan-kevitra PCR, inona ny kitapo ampiasaina, iza no mpanamboatra, ny haben'ny rafitra fanehoan-kevitra, na ny fomba fandokoana na ny fomba fanadihadiana no ampiasaina, ny fandaharana PCR.Ho hitan'ny mpamily efa za-draharaha fa raha mbola voafantina ny kitapo dia voafaritra amin'ny ankapobeny ny fampahalalana etsy ambony.
Amin'izao fotoana izao, ny fanamboarana sy ny famokarana ny fluorescent quantitative PCR dia teknolojia tena matotra.Raha mbola tsy misafidy mpanamboatra tena ratsy ianao, dia tsy dia lehibe ny mety hisian'ny olana, fa mbola te hizara aminareo hevitra vitsivitsy izahay:
Taq enzyme manomboka mafana:Ny ampahany manan-danja indrindra amin'ny PCR dia ny enzyme Taq mafana.Ny anzima manomboka mafana eny an-tsena dia mizara roa amin'ny ankapobeny, ny iray dia anzima fanombohana mafana novaina amin'ny fomba simika (azonao alaina sary an-tsaina izany ho toy ny paraffine embedding), ary ny iray hafa dia Enzyma fanombohana mafana ho an'ny fanovana antibody (antigen-antibody binding).Ny fanovana simika dia fomba voalohany amin'ny enzymes manomboka mafana.Rehefa tratra ny maripana iray dia hamoaka ny asany ny anzima.Mampiasa fomba biolojika hanakanana ny asan'ny anzima ny anzima mafana novaina amin'ny antibody.Rehefa tonga amin'ny mari-pana iray, ny antibody dia ho denatured sy tsy mavitrika toy ny proteinina, ary ny hetsika anzima dia ho raisina an-tsehatra.
Inona anefa no fampiasana izany?Izany no zava-misy, ny hetsika famotsorana ny anzima novaina antibody dia haingana kokoa noho ny an'ny anzima novaina simika, noho izany raha ny momba ny fahatsapan-tena dia manana tombony kely ny anzima novaina antibody, ka amin'ny ankapobeny dia tsy misy anzima novaina simika ao amin'ny kitapo eny an-tsena.Raha misy, dia mbola mijanona ao anatin'ny vanim-potoanan'ny arivo taona ny teknolojian'ity mpanamboatra ity.
Fifantohana ion manezioma:Ny fifantohana ion manezioma dia tena zava-dehibe amin'ny fihetsiky ny PCR.Ny fatran'ny ion magnesium mety dia afaka mampiroborobo ny famotsorana ny asan'ny enzyme Taq.Raha ambany loatra ny fifantohana dia hihena be ny asan'ny enzyme;raha ambony loatra ny fifantohana dia hihatsara ny fanamafisana tsy voafaritra manokana ataon'ny enzyme.Ny fifantohana amin'ny ion manezioma dia hisy fiantraikany amin'ny fanalefahana ny primers, ny mari-pana mitsonika ny môdely sy ny vokatra PCR, ka hisy fiantraikany amin'ny vokatra azo avy amin'ny sombintsombiny.Ny fifantohana amin'ny ion magnesium dia fehezina amin'ny 25mM amin'ny ankapobeny.Mazava ho azy fa ho an'ny kitapo tsara dia tsy maintsy fehezina tsara ny fifantohana amin'ny ion magnesium.Ny mpivarotra sasany dia manampy ny manezioma ion chelating agent amin'ny reagent, izay mety hahatratra ny vokatry ny fanitsiana mandeha ho azy ny fifantohana ion manezioma.
Fandokoana fluorescent:Ny lokon'ny fluorescent, izay ilay SYBR Green fampiasantsika matetika, dia miteraka fluorescence amin'ny ankapobeny amin'ny fatorana amin'ny tsipika kely amin'ny ADN mitongilana roa, satria tsy voafaritra ny fatoran'ny loko amin'ny ADN mitongilana roa, izany hoe raha mbola mitambatra amin'izany ny ADN mipetaka roa, dia mety hitranga ny fluorescence amin'ny rafi-pandrefesana, ka mahatonga azy ho famantarana ny fluorescence amin'ny ADN.
PS: Noho ny toetrany mora saro-pady, ny vokatra eny an-tsena amin'ny ankapobeny dia fonosina amin'ny fantsona centrifuge manjavozavo volontsôkôlà (araka ny aseho amin'ny sary etsy ambany).Hiatrika olana anefa izany.Sarotra ny mahita raha sempotra ny ranon-javatra rehefa maka santionany.Amin'io lafiny io, ny Qingke dia tena mora ampiasaina (araka ny aseho amin'ny sary etsy ambany), ary ny fantsona mangarahara dia fonosina ao anaty kitapo fanitso.Avy eo dia apetraho ao anaty kitapo fanindroany izany, amin'ny fiheverana ny maha-mora ny fisorohana ny hazavana sy ny santionany.Tsy maintsy misafidy ny laharana vokatra tsara ianao.TSE204 dia fisiana tena mandaitra, izay mahatonga ahy haniry hamboly ahitra.
Tena zava-dehibe koa ny fifantohana amin'ny loko fluorescent.Raha ambany loatra ny fifantohana dia tsy hiakatra amin'ny dingana manaraka ny curve amplification ary tsy tonga lafatra;raha ambony loatra ny fifantohana dia hiteraka fitsabahan'ny tabataba.Koa satria ny fluorescent quantitative PCR dia miankina indrindra amin'ny sandan'ny CT, raha tsy ahitsy tsara ny fifantohan'ny loko fluorescent, dia tsara kokoa ny teboka ambany noho ny teboka avo.Mazava ho azy fa ny fifantohana loko mifanaraka amin'izany no tsara indrindra.
ROX: Ny loko ROX dia ampiasaina hanitsiana ny fahadisoana famantarana ny fluorescence tsara.Ny mpanamboatra fitaovana sasany dia mitaky calibration, fa ny hafa kosa tsy manao izany.Ohatra, ny fampiasana ny fitaovana fanamafisam-peo PCR Real Time an'ny Thermo Fisher Scientific dia matetika mitaky calibration, ao anatin'izany ny 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, sns.
Ny qPCR Mix an'ny Foregene dia misy loko ROX ihany koa, izay mety ampiasaina amin'ny modely isan-karazany.
Ny fitsaboana fatorana hidrôzenina malemy: Ny fitsaboana ny fatorana hidrôzenina malemy dia raharaha ara-teknika.Tsy nisy namaky ny boky torolalana ho an'ny kitapo maro, saingy tsy nisy nanonona io lohahevitra io.Tena zava-dehibe tokoa izany.Ny fitambaran'ny fototra dia miankina indrindra amin'ny tanjaky ny fatoran'ny hidrôzenina.Ny fatorana hidrôzenina matanjaka dia fanamafisana ara-dalàna, ary ny fatorana hydrogen malemy dia mitarika amin'ny fanamafisana tsy voafaritra.Raha tsy azo esorina tsara ny fatorana hidrôzenina malemy, dia tsy azo ialana ny fanamafisam-peo tsy voafaritra.Ao anatin'ny sehatry ny mpanoratra, orinasa vitsivitsy ihany no nahatsikaritra ity olana ity.Rehefa mividy ny kitapo ianao dia azonao atao ny manamarina raha toa ianao ka nihevitra vahaolana amin'io lafiny io amin'ny kitapo tianao hofidiana.
Haben'ny fanehoan-kevitra: Ny rafitra 20-50ul dia ampiasaina matetika kokoa, ary ny boky kely kokoa dia mety hiteraka fahadisoana.Amin'ny ankapobeny, ny torolalan'ny kitapo dia hanoro ny fampiasana ny habetsaky ny fanehoan-kevitra PCR.Aza marani-tsaina ary mampiasa boky kely kokoa mba hitsitsiana ny fandaniana.ny tanjona ny.Ny boky natolotry ny mpivarotra dia tena nosedraina, ary mety ho tsy afaka mamaha ny olan'ny fahadisoana nateraky ny boky kely izy ireo.
2. Ny mpanamboatra sy ny laharan'ny lahatsoratra amin'ny takelaka fantsona
Samy mahafantatra ny fitsipiky ny fluorescent quantitative PCR.Ny fanangonana fluorescence dia atao amin'ny alàlan'ny satroka fantsona PCR.Rehefa misafidy fitaovana ampiasaina amin'ny PCR dia tandremo ny teboka roa: fampitana hazavana tsara ary mety amin'ny fitaovana.Amin'ny ankapobeny dia tsara ny boards sy tubes amin'ny marika mahazatra, saingy tsy maintsy misafidy tsara ianao amin'ny resaka fampifanarahana, raha tsy izany dia tsy ho afaka hampiasa ilay fitaovana ianao.
4. Fahalalana ambony indrindra
MIQE (8)—fanamarinana qPCR
Ity no laharam-pahamehana voalohany amin'ny qPCR!Be dia be ny mahery fo latsaka tao anaty fasika eto.Mazava ho azy fa mety ho tsara vintana ihany koa ianao ary tsotra ny fototarazo nianaranao, ka nitsinkafona tamin'ny lava-dranomandry niaraka tamin'ny rivotra ianao.Ny fampahafantarana fanamarinana ny qPCR dia natao hitsapana ny fahamendrehan'ny angon-drakitra.Tanisainay toy izao manaraka izao ny fampahalalana fanamarinana ilaina:
1. Fitsapana manokana
Ny maha-tokana ny fanamafisan'ny fototarazo kendrena dia sedraina amin'ny fanamarinana raha tarika tokana ny sarin'ny electrophoresis;fanamarinana sequencing;curve mitsonika hahitana raha tokana ny sarintany tampon'isa;fanamarinana fandevonan-kanina sy fomba hafa.
Eto isika dia mifantoka amin'ny tfamakafakana ny fanamafisam-peo tsy voafaritra amin'ny alalan'ny fomba fikorianan'ny levona.Amin'ny ankapobeny, rehefa mamolavola primers isika, ny haben'ny sombin-tsakafo dia takiana amin'ny 80-200bp, izay mahatonga ny mari-pana mitsonika ny vokatra PCR 80-85 ° C.Noho izany, raha misy tampony isan-karazany, dia tsy maintsy misy vokatra hafa amplification tsy voafaritra;raha toa ka eo ambanin'ny 80°C ny tendrony dia heverina ho dimer primer izy io;raha toa ka mihoatra ny 85°C ny tampony dia heverina ho fandotoana ADN na fanamafisam-peo tsy voafaritra mazava kokoa amin'ny sombiny lehibe.
Fanamarihana: Indraindray dia misy tampony tokana amin'ny 80 ° C.Amin'izao fotoana izao dia tsy maintsy arahina io foto-kevitra io.Azo inoana fa ny vokatra fanamafisam-peo dia dimer primer daholo.
Curve mitsonika mahazatra (peak tokana tsy misy fanamafisam-peo tsy voafaritra)
Curve mitsonika olana (fanamafisana tsy voafaritra amin'ny tendrony sandoka)
【Famakafakana tranga】
Misy tampony lehibe, fa ny dimer primer dia matotra
Mety hamitaka mora foana ny masonao ny curve mitsonika tampon'isa tokana amin'ny sary etsy ambany, mieritreritra fa fanandramana tonga lafatra izany, saingy diso tanteraka ny vokany.Amin'izao fotoana izao dia mila mijery ny mari-pana mitsonika isika.Ny mari-pana ambony indrindra dia ambanin'ny 80 ° C, izay primer-dimer tanteraka.
Tsy misy sombintsombiny kendrena, dimer primer rehetra
Eto, tsy afaka mijanona ny rahalahiko.Ny sary etsy ambany dia sary nalaina tamin'ny finday nalefan'ny scumbag ho ahy.Ny reagents nampiasainy dia marika fampiasa rehetra amin'ny indostria.Niova marika T-prefix iray ho marika T-prefix hafa izy.Heveriko fa efa noeritreretinao izany.Nitomany tamiko ilay jiolahy hoe: “Tsara loatra ilay reagent ampiasaina amin'ny sary voalohany, ary tokana ny tampony.Taty aoriana, rehefa avy nampiasa ny reagent narosonao, dia lasa toy ny sary faharoa, miaraka amin'ny tendrony mifangaro.Nampahory ahy ianao.“
Saraho ny grafika roa.Raha vao jerena, ny iray dia manana tampony tokana, ary ny iray manana tampony roa.Tsy misy dikany, ny tampony tokana dia mazava ho azy fa tsara.Marina ve izany?
Ratsy noho i Dou E, raha apetrako eo amin'ny sary etsy ambany ireo sary roa ireo dia ho azonao avy hatrany.Raha ny marina, dia mora mandringa isika noho io karazana sary io.Taorian'ny famakafakana tsara dia hitanay fa: ny tampon'ny tarehimarika voalohany dia eo amin'ny 75°C, izay dimer primer tanteraka;Ny tampon'ny tarehimarika faharoa dia miseho amin'ny 75 ° C sy 82 ° C, farafaharatsiny misy Ny vokatra dia miseho.
Sary fanehoan-kevitra avy amin'ny mpianatra
Noho izany, ny olana fototra dia tsy ny olana amin'ny reagents, fa ny olana amin'ny famolavolana primer.Etsy andanin'izay dia manaporofo ihany koa fa tsy manana kalitao vy ny marika lehibe sasany, ary manaporofo ihany koa ny voalazan'ny rahalahiko taloha hoe: Tsy ny marika reagent no manohana ny lahatsoratrao.Ny lahatsoratrao no nanohana ny marika reagents.Alao sary an-tsaina fotsiny, raha tsy nanova ny reagents ny scumbag, dia alefa any amin'ny gazety ny angon-drakitra diso, ary ny zavatra hitranga dia loza.
2. Ct sandan'ny fanaraha-maso banga
Aza hazavaina, raha manana sanda Ct ny fanaraha-maso banga, sa tsy loto izany?Na izany aza, mbola mila mahafantatra ianao hoe inona ny fanaraha-maso banga manana sanda Ct.Raha NTC izany dia midika izany fa misy ADN vahiny toy ny fandotoana reagent.Raha NRT ilay izy, dia midika izany fa misy fandotoana ADN ny ARN nalaina.
3. Ny curve mahazatra
Ao anatin'izany ny raikipohy sy ny fikajiana, ny fahombiazan'ny PCR dia azo kajy amin'ny alàlan'ny formula.Ny fanandramana tonga lafatra dia mitaky ny fisondrotry ny curve mahazatra hanatona ny 3.32, ary ny R² hanatona ny 0.9999.
4. Linear dynamic range
Ny isan-karazany mavitrika ny fanehoan-kevitra dia linear.Araka ny môdely ampiasaina amin'ny famoronana curve manara-penitra, ny isan-karazany mavitrika dia tokony ahitana gradients 5 farafahakeliny, ary diniho ny fiovan'ny sanda Ct amin'ny gradients avo lenta sy ny gradients ambany.
5. Fahamarinan'ny fitiliana
Ny fiovan'ny valin'ny qPCR, izany hoe, ny tsy fahampian'ny famerenana, izany hoe, ny tsy fahampian'ny fahamendrehana, dia vokatry ny anton-javatra maro, anisan'izany ny mari-pana, ny fifantohana ary ny fiasana.Amin'ny ankapobeny dia lasa tsy voafehy ny fahitsiana qPCR rehefa mihena ny isan'ny kopia.Ny fiovana tsara indrindra ao anatin'ny fanandramana, ity fiovaovana ara-teknika ity dia tokony hiavaka amin'ny fiovaovana biolojika, ary ny replika biolojika dia afaka miresaka mivantana ny fahasamihafan'ny statistika amin'ny valin'ny qPCR eo amin'ny vondrona na fitsaboana.Indrindra ho an'ny fitsirihana diagnostika, tsy maintsy taterina ny mari-pandrefesana inter-assay tsara indrindra (famerenana) manerana ny tranokala sy ny mpandraharaha.
6. Fahombiazana sy LOD (amin'ny qPCR multiplex)
Ny LOD dia ny fifantohana ambany indrindra amin'ny 95% amin'ny santionany tsara hita.Raha lazaina amin'ny teny hafa, ny fifantohana amin'ny LOD voarakitra ao anatin'ny fitambaran'ny fototarazo kendrena dia tsy tokony hihoatra ny 5% amin'ny fanehoan-kevitra tsy nahomby.Rehefa manao famakafakana qPCR multiplex, indrindra ho an'ny fitiliana simultaneous ny fiovan'ny teboka na ny polymorphism, ny multiplex qPCR dia mila manome porofo fa ny fahamarinan'ny sombintsombin'ny kendrena maromaro dia tsy mampandefitra ao anaty fantsona iray, ny fitiliana marobe sy ny fitiliana fantsona tokana Efficiency sy LOD dia tokony hitovy.Indrindra fa rehefa ampitomboina miaraka ny fototarazo kendrena avo lenta sy ny fototarazo kendrena ambany, dia tsy maintsy dinihina io olana io.
Olana sy vahaolanaAmin'ny ankapobeny dia mifantoka amin'ireto lafiny manaraka ireto ny olana atrehana matetika amin'ny debugging qPCR:
· fanamafisam-peo tsy voafaritra
· Safidy sarotra ny fifantohana voalohany sy ny olana amin'ny dimer primer
· Tsy marina ny hafanan'ny annealing
· Ny rafitra faharoa dia misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny amplification
amplification tsy voafaritra
amplification tsy voafaritramitranga , dia heverina amin'ny ankapobeny raha tsy mety ny famolavolana primer, fa raha tsy maika hanova ny primer ianao dia azonao atao ny manandrana ireto fomba manaraka ireto aloha (miraikitra ihany koa ny fitsipika):
· Ampitomboy ny mari-pana fanalana – miezaha hanao fatorana hidrôzenina malemy tsy ho voatana;
· Hafohezina ny fotoana fanalefahana sy fanalavam-potoana - mampihena ny mety hisian'ny fatorana hidrôzenina malemy;
· Mampihena ny fifantohana voalohany - mampihena ny mety hamehezana ny primers sy ny faritra tsy kendrena;
Low amplification fahombiazana
Ny toe-javatra mifanohitra amin'ny fanamafisam-peo tsy voafaritra - ny fahombiazan'ny amplification ambany, ary ny fepetra hiatrehana ny fahombiazan'ny amplification ambany dia mifanohitra amin'izany ihany:
· Manalava ny fotoana fanalana sy fanitarana;
· Ovay amin'ny PCR dingana telo ary ahena ny mari-pana fanalana;
· Ampitomboy ny fifantohana voalohany;
Ps: Maro ny mpianatra nahazo diplaoma teraka tamin'ny taona 90 no tsy te hianatra ny fomba debug andrana, ary manantena fa ny kitapo dia afaka mamaha tanteraka ny olana (raha te-handeha any amin'ny orinasa reagent hanao fikarohana sy fampandrosoana rehefa nahazo diplaoma), raha ny marina, ny mpanamboatra reagent koa dia mihevitra toy izany, manantena aho fa adala izany azo ampiasaina rehefa mahazo azy, noho izany dia maro ny reagent ezaka mba hamahana ny olana tsy misy ny amplification ny amplifier. malemy H-fatorana absorption anton-javatra.Mba hamahana mora foana ny olana, ny adala dia mbola mila mamaky ny fampidirana ny orinasa reagent mba hahitana raha misy anton-javatra mitroka ny fatorana hydrogène malemy.
Safidy sarotra ny fifantohana primer sy olana amin'ny primer-dimer
Fomba 1: Amin'ny ankapobeny, ny torolalan'ny kit ho an'ny qPCR dia nanoro ny rafitra ary nanoro ny fifantohana voalohany.
Fomba 2: Debugging amin'ny alàlan'ny fametrahana ny gradient concentration primer.Ny sary etsy ambany dia nangalatra tamina orinasa iray mba hanehoana.Ny sary eto ambany dia mampiseho ny valin'ny fatran'ny fluorescence natao tamin'ny gradients concentration telo voalohany (100nM, 250nM, 500nM) ary ny gradients concentrate template efatra (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Ny sandan'ny Ct amin'ny valin'ny andrana dia alaina toy izao manaraka izao:
Fifantenana ny fifantohana voalohany Ampifandraiso amin'ny tsipika toy izao manaraka izao ny fifantohana voalohany:
Ny safidy ny primer fifantohana dia miharihary, ny linear fifandraisana ny primer fifantohana amin'ny 100nM sy 250nM tsara kokoa, ary ny linear fifandraisana ny primer fifantohana ny 500nM dia somary mahantra.Ao amin'ny 100nM sy 250nM, ny sandan'ny Ct amin'ny 250nM dia kely, noho izany dia 250nM ny fifantohana voalohany indrindra.Amin'ny ankapobeny, ny primer-dimer mahery dia hita ao amin'ny curve mitsonika.Ahoana raha tsy afaka misoroka ny primer-dimer ny primer namboarina?
Fomba 3: Ahena ny fatran'ny primer ary ampitomboy ny mari-pana fanalana (tsy mila hazavaina).
Ny sandan'ny empirical ny mari-pana annealing dia 60 ° C.Raha tsy azonao antoka, ahoana no hisafidianana ny mari-pana annealing mety kokoa?Ny valiny dia mitovy amin'ny fisafidianana ny fifantohana voalohany -fitsapana gradient.Makà sary avy amin'ny orinasa Bio-rad mba hanehoana ny olana.Mba hanamafisana ny sombintsombiny kendrena iray, dia mametraha gradients mari-pana valo, izay misy famerimberenana telo, ary ny curve fanamafisam-peo azo dia toy izao manaraka izao:
Fantenana mari-pana annealing:
· 70°C, 69°C—Raha ny tokony ho izy dia tsy azo atambatra ny primers, ka tsy misy fanamafisam-peo.
· 67,3°C – Misy fampitomboana kely eo am-piandohana, ary somary lehibe ny sandan’ny Ct.
·64,5°C——Mihena ny sanda Ct.
· Ao amin'ny 60,7 ° C, 58,0 ° C, 56,2 ° C, ary 55,0 ° C, ny sanda Ct amin'ny ankapobeny dia nirona ho stable, fa ny sanda fluorescence farany dia hafa.
Ahoana ny fisafidianana?Fitsipika: Ny fitsipika voalohany dia ny sanda Ct ambony.Ho an'ny sandan'ny Ct mitovy, mifidiana mari-pana fanalana avo kokoa mba hisorohana ny dimerization sy ny fanamafisana tsy voafaritra.Na dia misy ny sandan'ny fluorescence ambony kokoa amin'ny 55 ° C, dia mety misy dimer na fanamafisana tsy voafaritra ao anatiny.
Fa raha marani-tsaina toa anao ianao, dia azo antoka fa hieritreritra ianao hoe: Raha lojika, raha tena voafaritra tsara ny fihetsiky ny PCR, raha toa ka mihoatra ny fepetra faran'izay kely indrindra ny fifantohana voalohany, dia tsy tokony hisy fiantraikany ny teboka avo sy ambany, toy ny loko fluorescent sy dNTP.Eny tokoa, raha mbola amboarina araka ny tokony ho izy ny mari-pana fanalana azy, dia hihena ho azy ny fiantraikan'ny fifantohana voalohany amin'ny sandan'ny Ct.
Ny mari-pana fanalefahana dia amboarina araka ny tokony ho izy, ary hihena ny fiantraikan'ny fifantohana voalohany amin'ny CT
Ny rafitra faharoa dia misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny amplification
Andao haka ny sary avy amin'ny Bio-rad mba hanehoana ny olana.Izy io koa dia mamolavola gradient mari-pana mba hanamafisana fototarazo misy rafitra faharoa.
Mipoitra ny rafitra faharoa
Hita fa rehefa mihena ny mari-pana dia manomboka miseho ny vokatra ary mandroso ny sandan'ny Ct, mahatratra ny sanda kely indrindra amin'ny 60,7 ° C, ary rehefa mihena ny mari-pana dia mihamitombo ny sanda Ct.Mifanohitra amin'izany, rehefa mitombo ny mari-pana, dia misokatra ny rafitra faharoa ary mitombo ny fahombiazan'ny amplification.Rehefa tonga amin'ny mari-pana iray dia tsy afaka manatsara ny fahombiazan'ny amplification ny fampitomboana ny mari-pana.Satria tsy afaka mitambatra tsara ireo primers amin'izao fotoana izao.Noho izany,tadiavo ny mari-pana manana sanda Ct ambany indrindra, izay mari-pana tsara indrindra hanamafisana ny môdely rafitra faharoa!Mazava ho azy, ny adala hendry dia tsy maintsy mahafantatra fa raha tsy ilaina izany, dia tsara kokoa ny manova ny primers ary misoroka ny faritra rafitra faharoa.
5. Ambaratonga fampiharana
MIQE—Fanadihadiana angona
Ny famakafakana angon-drakitra dia omena indrindra amin'ny fitaovana PCR fluorescent quantitative.Ao amin'ny lahatsoratra teo aloha, betsaka ny asa famakafakana angon-drakitra natao, toy ny fanaraha-maso banga, izay nohazavaina tamin'ny famolavolana ny fanandramana.Nohazavaina ny fototarazo anatiny, ny isa miverimberina, sns., eto no hazavainay indrindra ny fampiharana ny qPCR.
Ny qPCR dia ampiasaina betsaka, ary ny fanamarinana andrana sy ny fitiliana asidra nokleika no toe-javatra mahazatra indrindra.
quantification tanteraka
Ny log (fifantohana voalohany) dia misy ifandraisany amin'ny isan'ny tsingerina.Ny curve manara-penitra dia azo alaina avy amin'ny fenitra iray fantatra amin'ny isa kopia voalohany, izany hoe ny fifandraisana an-tariby amin'ny fanehoan-kevitry ny amplification dia azo alaina.Araka ny sandan'ny Ct amin'ny santionany, ny fifantohana amin'ny santionany dia azo kajy.Ny habetsahan'ny môdely ampidirina.
Fomba kajy quantitative tanteraka
Ny fandrefesana tanteraka dia tsy maintsy mifototra amin'ny curve mahazatra.Mba hanaovana curve mahazatra dia ilaina ny manara-penitra.Matetika, ny fenitra dia plasmid azo avy amin'ny kloning ny fototarazo kendrena.Nahoana izy io no plasmid?Satria ny ADN plasmid boribory no miorina tsara indrindra.Dilute ny vokatra mahazatra amin'ny 5 ka hatramin'ny 6 gradients araka ny tahan'ny avo roa heny (10-fold dilution), ary tandremo ny fitoviana rehefa manalefaka.Avelao hidina eo anelanelan'ny 15-30 ny sanda Ct.
Fiomanana mahazatra
Mandritra izany fotoana izany, ny santionany hotsapaina dia tokony ho levona mifanaraka amin'izany (tadidio ny anton'ny dilution), ary ny sanda Ct dia tokony hianjera eo anelanelan'ny 15-30.Ny vokatra manara-penitra + ny santionany hotsapaina dia apetraka amin'ny milina miaraka.Taorian'ny fihazakazahana dia nisy curve manara-penitra natao tamin'ny akora manara-penitra, ary ny santionany hotsapaina dia nentina tao amin'ny curve mahazatra mba kajy ny fifantohana.
Ny viriosy hepatita B Ny fandrefesana ny viriosy HBV dia fanombanana tanteraka, izay afaka manisa ny laharan'ny dika mitovy amin'ny viriosy ao anaty ra 1ml.
Kajy ny laharan'ny kopia
Santionany fifantohana hotsapaina (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × dilution factor
Lanja molekiola santionany = isan'ny fototra × 324
Ny laharan'ny dika mitovy amin'ny santionany hotsapaina (kopia/ul) = ny fifantohan'ny santionany hotsapaina / ny lanjan'ny molekiolan'ny santionany × 6 × 1014
Fomba kajy ny laharan'ny kopia
Ity ambony ity no fomba kajy hamaritana ny isa.Olana matematika izay azo vahana rehefa vita ny fianarana ambaratonga faharoa, ary ny olan'ny matematika dia matetika voavaha amin'ny ordinatera.Raha tsy azonao dia afaka tonga hifandray.
quantification relatif
Ny quantification relatif dia ampiasaina indrindra amin'ny fikarohana siantifika.Firy ny viriosy ao anatin'ny ra 1ml, ary virus ADN io, hetsika somary voafaritra io: azo fantarina ny habetsahan'ny ra, ary ny virus ADN dia somary stable.Sarotra amintsika anefa ny mampitaha ny isan'ny dika mitovy amin'ny fototarazo iray ao anaty ravin-kazo iray, satria sarotra ny mamaritra ny habeny, ny lanjany ary ny halemem-pon'ny raviny, sarotra ny hamaritana ny habetsaky ny ARN nalaina, ary sarotra ihany koa ny mamaritra ny fahombiazan'ny fandikana mivadika, izany hoe, ny dingana rehetra dia mety hahatonga ny angon-drakitra andrana ary tsy azo ampiasaina.
Noho izany, ny quantification relatif dia tsy maintsy mampiditra singa iray:ny fototarazo anatiny .
Raha lazaina amin'ny teny hafa, ny fandrefesana relatif dia fampitahana ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo anatiny.Raha ampitahaina amin'ny sela mitovy sy ny sela iray ihany, dia kely ny fiantraikan'ny haben'ny santionany, ny habetsahan'ny fitrandrahana RNA, ny fahombiazan'ny fandikana mivadika, ary ny fahombiazan'ny PCR.Noho ny haben'ny santionany kely dia nihena ny fototarazo anatiny sy ny fototarazo kendrena.Izany no antony nanasongadinana ny fitoniana sy ny fitoniana teo aloha.
Ny fototarazo anatiny dia amin'ny ankapobenyfototarazo fikarakarana trano( fototarazo fitahirizana trano), izay manondro ny kilasin'ny fototarazo izay mibaribary amin'ny sela rehetra, ary ny vokatra azony dia ilaina mba hihazonana ny asa fototra amin'ny fiainan'ny sela.
Aza afangaro io hevitra io.Ny fototarazo ao an-trano dia teny biolojika, raha ny fototarazo anatiny kosa dia teny teknika andrana.Ny fototarazo fitahirizana trano dia mila mandalo fanamarinana alohan'ny hisafidy azy ireo ho fototarazo anatiny.
Ohatra, nisafidy fototarazo fikarakarana trano maromaro ao amin'ny sary etsy ambany izahay mba hitsapana ny haavon'ny fanehoana azy amin'ny sela sela samihafa, ary hita fa tsy mitovy amin'ny an'ireo fototarazo telo hafa ny haavon'ny fanehoana ny β-2-microglobulin, ka tsy azo ampiasaina ho fototarazo anatiny.
Taorian'ny fahatakarana ny fiasan'ny fanitsiana ny fototarazo anatiny, dia misy algorithms roa azo avy amin'ny fampidirana ny fototarazo anatiny.
·fomba curve manara roa
·2 – △△Ct fomba (fomba fampitahana sanda CT)
Raha liana amin'ny fandalinana karazana sy ny asan'ny fototarazo ianao dia avelao ny fikarohana momba ny algorithm ary ampiasao mivantana ny formulas, na ampiasao mivantana ny milina;raha lehilahy mahitsy amin'ny matematika sy injeniera ianao dia aza misalasala.
fomba curve manara roa
Famaritana ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo fitahirizana trano amin'ny santionany fanaraha-maso sy ny santionany hotsapaina amin'ny alàlan'ny curve manara-penitra, ary avy eo kajy ny sanda mifandraika amin'ny fikajiana, izay ny haavon'ny fanehoana.
Tombontsoa: famakafakana tsotra, fanatsarana andrana tsotra
Ny tsy fahampiana: Ho an'ny fototarazo tsirairay, ny fihodinan'ny andrana tsirairay dia tsy maintsy manao curve mahazatra
Fampiharana: Iray amin'ireo fomba roa be mpampiasa indrindra sy fantatra amin'ny fandalinana ny fitsipi-pitenenana ny fototarazo
Ny formula dia toy izao manaraka izao:
Ireto misy ohatra:
Kajio ny sandan'ny isam-bolana mifototra amin'ny vokatra azo
2 – △△Ct fomba (fomba fampitahana sanda CT)
Tombontsoa: Tsy mila manao curve mahazatra
Ny tsy fahampiana: Heverina fa ny fahombiazan'ny amplification dia manakaiky ny 100%;ny fivilian-dàlana mahazatra dia <5%, ary ny curve mahazatra sy ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo tsirairay dia heverina ho tsy miova;ny fanatsarana ny fepetra andrana dia sarotra kokoa.
Fampiharana: Iray amin'ireo fomba roa be mpampiasa indrindra sy fantatra amin'ny fandalinana ny fitsipi-pitenenana ny fototarazo
Mazava ho azy, ny fahombiazan'ny amplification dia matetika tsy azo atao ho tonga lafatra 1. Fomba fanitsiana: Raha fantatsika fa ny fototarazo kendrena sy ny fototarazo reference dia mitovy ny fahombiazan'ny amplification, fa ny amplification efficiency dia tsy mitovy amin'ny 1, dia 2－△△Ct azo ahitsy toy ny: (1+E)－△△Ct, ohatra, ny fampandehanana ny lc. 1.95－△△Ct
Hatreto, nifarana ny votoatin'ny PCR quantitative fluorescent.
Fotoana fandefasana: Apr-06-2023
