Miresaka momba ny fitsipiky ny andrana qRT-PCR ny rehetra, ny famolavolana voalohany, ny fandikana ny valiny, sns., saingy heveriko fa tokony hizara aminareo ny asa andrana ny qRT-PCR.Kely izy io, fa momba ny vokatra.
Alohan'ny hanaovana qRT-PCR dia mila manana fahatakarana mazava momba ny RNA sy ny fomba fiasantsika manokana isika.Ny ezaka ataontsika rahateo dia mikendry ny hahazoana vokatra fa tsy manao fanazaran-tena fotsiny.Noho izany alohan'ny hanaovana qRT-PCR dia mila mamaritra ireto olana manaraka ireto isika (ny sasany amin'izy ireo dia azo ampiharina amin'ny SYBR ihany).
1 Azo antoka ve fa tsy simba ny ARN-nao?
NanoDrop 2000 dia tsy afaka mahita afa-tsy ny fifantohana sy ny fahadiovan'ny ARN, fa tsy afaka mamantatra ny fahamarinan'ny ARN.
Ny sandan'ny RNA (RNA Intesity Number) dia afaka maneho ny fahamendrehan'ny RNA, izay hitan'ny rafitra Agilent 2100 Bioanalyzer.
Fig. Diagram schematic momba ny soatoavin'ny RIN ho an'ny santionany RNA samihafa (eukaryotes)
Na izany aza, ny laboratoara amin'ny ankapobeny dia tsy manana Agilent 2100 Bioanalyzer.Amin'ity tranga ity dia afaka mahita amin'ny alàlan'ny gel formaldehyde isika, fa ny fepetra takiana amin'ny totalin'ny ARN dia avo, ka ny fomba haingana indrindra dia ny fampiasana electrophoresis gel mahazatra.Ilaina ny ho ao anatin'ny tontolo tsy misy nuclease, noho izany dia ilaina ny manasa ny electrophoresis tank, sol tavoahangy, gel bracket sy ny tohotra amin'ny rano DEPC.Ny agarose koa dia tsy misy nuclease (raha mbola vao misokatra), ary ny Loading Buffer dia tokony hosokafana vao haingana araka izay azo atao, miaraka amin'ny gel 1,2%.
Mariho fa ny gel dia tsy maintsy levona tanteraka, raha tsy izany dia hiteraka inhomogeneous tarika, araka ny aseho amin'ny santionany 9 eo amin'ny sary.Raha toa ka avo loatra ny voltora na mandeha lava loatra dia hiteraka hafanana ary hiteraka fahasimbana ny ARN, noho izany dia tokony hofehezina ara-drariny ny voltora sy ny fotoana.Fanampin'izany, ny fampandehanana gel dia afaka mamaritra bebe kokoa raha misy sisa tavela amin'ny ADN ao amin'ny santionany, ary diniho raha misy tarika voatazona betsaka ao amin'ny lavadrano.
Sary.Gel electrophoresis detection ny ARN
2 Tena azonao antoka ve ny habetsahan'ny cDNA-nao?
Ny traikefan'ireo rahalahy lehibe ao amin'ny laboratoara dia ny cDNA amin'ny rafitra 20 ul azo amin'ny fanodikodinam-bola tsirairay dia voadio mivantana 20X, raha ny anabavy postdoctoral dia natsofoka 10X.Matetika aho no miankina amin'ny toe-javatra.Satria tsy mitovy ny kalitaon'ny ARN resahin'ny olona tsirairay, ny haavon'ny fiverenana dia hafa ihany koa, ary ny teknolojia fanodinana dia mety tsy milamina.
Noho izany, isaky ny mahazo ny cDNA mivadika aho, dia alehako in-3 eo ho eo aloha, ary avy eo dia mampiasa ny fototarazon'ny trano hanaovana RT-PCR, ny isan'ny tsingerina amin'ny ankapobeny dia 25 cycles, mba hamantarana ny fifantohana manokana, ary avy eo hamaritana ny anton'ny dilution farany.
3 Azo antoka ve fa mora ampiasaina ny primero?
Afaka mandalo ny curve mitsonika ny qRT-PCR izy io, saingy mbola mandany vola izany.Ho an'ny laboratoara tsy misy vola be, rehefa mahazo primer be dia be izy ireo, dia afaka mampiasa RT-PCR mahazatra izy ireo mba hahitana raha tarika tokana izy io ary hamantatra ny maha-tokana ny primers.Raha tsy ampy vola ny laboratoara, dia azo fantarina indray mandeha amin'ny alàlan'ny curve mitsonika ny maha-tokana ny primer rehetra.
4 Azonao antoka ve fa mety ny fepetra andranao?
Ny SYBR dia tokony harovana amin'ny hazavana mahery, koa miezaha hamono ny jiro ambony rehefa manampy SYBR reagent, ary mila mampiasa hazavana manjavozavo fotsiny mba hamitana azy.
Tehirizo SYBR amin'ny 4°C.Rehefa ampiasaina dia atsipazo moramora miakatra sy midina mba hifangaro tsara mba tsy hisian'ny vory, ary aza vortex mafy.
Ny anabavy sasany dia tia manao marika eo amin'ny solaitrabe PCR noho ny tahotra ny hampifangaro ny santionany, izay tsy mety.Satria mety hisy fiantraikany amin'ny fanangonana famantarana fluorescent ny marikao, dia manoro hevitra ny zandriny aho mba hampiasa kahie andrana mba hanampy amin'ny fitadidiana, araka ny aseho etsy ambany.
Sary.qRT-PCR santionany santionany santionany diagram
5 Azo antoka ve fa tsara ny ataonao?
Ataovy azo antoka ny manao fonon-tanana, manao fonon-tanana, manao fonon-tanana, ary milaza zavatra manan-danja in-telo.
Mba hampihenana ny famirapiratan'ny SYBR amin'ny hazavana, izaho manokana dia te-hanampy môdely aloha, araka ny asehon'ny sary etsy ambany.Araka ny traikefa, mety hiteraka hadisoana amin'ny santionany ny fampidirana môdely kely.Noho izany, mba hanamaivanana ny fahadisoana nateraky ny fampidirana kely ny môdely, dia matetika aho avo roa heny ny santionany, ary avo roa heny ny santionany rehefa manampy ny santionany mba hampihenana ny habetsaky ny H2O2 nanampy.
Sary.Diagram schematic amin'ny entana qRT-PCR
Avy eo amboary ny rafitra qRT-PCR toy izao manaraka izao.
Sary.qRT-PCR diagram fanomanana rafitra
FANAMARIHANA: Mila atao amin'ny ranomandry ny fizotry ny fanamafisana.
Aorian'ny fampidirana ny santionany dia apetaho ilay sarimihetsika famehezana mangarahara.Andramo ny tsy hikasika ny endrik'ilay sarimihetsika famehezana mangarahara amin'ny tananao, miasa fotsiny avy amin'ny habaka amin'ny lafiny roa amin'ilay sarimihetsika.Satria mety hisy fiantraikany amin'ny fanangonana famantarana fluorescent koa ny dian-tanana.Avy eo dia ampiasao centrifuge mba hiantohana haingana mandritra ny 10 s amin'ny hafainganam-pandeha ambany mba hisorohana ny santionany tsy hihantona amin'ny rindrina.
Vokatra mifandraika:
Fotoana fandefasana: Apr-28-2023
