Fihenam-bidy lehibe amin'ny China High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2
Efa za-draharaha mpanamboatra.Mahazo ny maro an'isa amin'ny fanamarinana manan-danja amin'ny tsenany ho an'ny fihenam-bidy lehibe amin'ny China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Ny kalitao dia ny fiainan'ny orinasa, ny fifantohana amin'ny fangatahan'ny mpanjifa no loharanon'ny fahaveloman'ny orinasa sy ny fampandrosoana, Mifikitra amin'ny fahamendrehana sy ny toe-tsaina miasa tsara izahay, miandrandra ny fahatongavanao!
Efa za-draharaha mpanamboatra.Mahazo ny maro an'isa amin'ny fanamarinana manan-danja amin'ny tsenanyChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ny orinasa dia mampanantena: vidiny mirary, fotoana famokarana fohy ary serivisy aorian'ny varotra mahafa-po, dia miarahaba anao koa izahay hitsidika ny orinasa amin'ny fotoana rehetra tianao.Enga anie mba hanana raharaham-barotra mahafinaritra sy maharitra miaraka isika !!!
Famaritana
Ity kitapo ity dia mampiasa rafitra lysis buffer tokana izay afaka mamoaka haingana ny RNA avy amin'ny santionan'ny sela kolontsaina ho an'ny fanehoan-kevitra RT-qPCR, ka manafoana ny fizotran'ny fanadiovana RNA mandany fotoana sy miasa.Ny môdely RNA dia azo alaina ao anatin'ny 7 minitra monja.Ny 5×Direct RT Mix sy ny 2×Direct qPCR Mix-SYBR reagents nomen'ny kitapo dia afaka mahazo haingana sy mahomby ny valin'ny PCR amin'ny fotoana tena izy.
5 × Direct RT Mix sy 2 × Direct qPCR Mix-SYBR dia manana fandeferana mahery vaika, ary ny lysate ny santionany dia azo ampiasaina ho modely ho an'ny RT-qPCR mivantana.Ity kitapo ity dia misy ny RNA tsy manam-paharoa amin'ny Foregene reverse transcriptase, ary Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, réaction buffer, PCR optimizer ary stabilizer.
fepetra arahana
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Kit singa
Fizarana I | Buffer CL |
Foregene Protease Plus II | |
Buffer ST | |
Fizarana II | ADN Eraser |
5× Direct RT Mix | |
2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
50 × ROX Reference Fandokoana | |
RNase-Free ddH2O | |
torolalana |
Toetra & tombony
■ Tsotra sy mahomby : miaraka amin'ny teknolojian'ny Cell Direct RT, ny santionan'ny RNA dia azo alaina ao anatin'ny 7 minitra monja.
■ Kely ny fitakiana santionany, hatramin'ny sela 10 no azo andrana.
■ Fampidirana avo lenta: afaka mamantatra haingana ny RNA ao amin'ny sela kolontsaina ao amin'ny takelaka 384, 96, 24, 12, 6-lavadrano izy.
■ ADN Eraser dia afaka manala haingana ireo génome navoaka, mampihena be ny fiantraikan'ny voka-panadinana manaraka.
■ Optimized RT sy qPCR rafitra mahatonga ny roa-dingana RT-PCR transcription mivadika ho mahomby kokoa sy PCR manokana kokoa, ary mahatohitra kokoa RT-qPCR fanehoan-kevitra inhibitors.
Fampiharana kit
Fampiharana: cellule cultié.
- RNA navoakan'ny santionany lysis: azo ampiharina amin'ny maodely RT-qPCR an'ity kitapo ity ihany.
- Ny kitapo dia azo ampiasaina amin'ireto tanjona manaraka ireto: famakafakana fanehoana ny fototarazo, fanamarinana ny vokatry ny fampanginana ny fototarazo mpanelanelana siRNA, fitiliana zava-mahadomelina, sns.
Kisary
Fitehirizana sy ny fiainana talantalana
Ny ampahany I amin'ity kitapo ity dia tokony hotehirizina amin'ny 4 ℃;Ny ampahany II dia tokony hotehirizina amin'ny -20 ℃.
Ny Foregene Protease Plus II dia tokony hotehirizina amin'ny 4 ℃, aza mangatsiaka amin'ny -20 ℃.
Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR dia tokony hotehirizina amin'ny -20 ℃ ao anaty haizina;raha ampiasaina matetika, dia azo tehirizina ao amin'ny 4 ℃ ihany koa ho an'ny fitehirizana fohy (ampiasaina ao anatin'ny 10 andro). Izahay dia mpanamboatra za-draharaha.Nahazo ny maro an'isa amin'ny fanamarinana manan-danja amin'ny tsenany ho an'ny fihenam-bidy lehibe any Shina High Sensitivity One-Step Probe Rt-Qpcr Kit V2, Ny kalitao dia ny fiainan'ny orinasa, mifantoka amin'ny fangatahan'ny mpanjifa no loharanon'ny fahaveloman'ny orinasa sy ny fampandrosoana, Mifikitra amin'ny fahamendrehana sy ny toe-tsaina miasa tsara izahay, miandrandra ny fahatongavanao!
fihenam-bidy lehibeChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ny orinasa dia mampanantena: vidiny mirary, fotoana fohy famokarana ary serivisy aorian'ny varotra mahafa-po, dia miarahaba anao koa izahay hitsidika ny orinasa amin'ny fotoana rehetra tianao.Enga anie mba hanana raharaham-barotra mahafinaritra sy maharitra miaraka isika !!!
QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman
Cat.No.DRT-01021/01022
Ho an'ny sela mivantana RT-qPCR mampiasa sela ≤ 1000,000
Fampidirana vokatra
Ity vokatra ity dia mampiasa rafitra lysis buffer tsy manam-paharoa mba hamoahana haingana ny RNA avy amin'ny santionan'ny sela kolontsaina ho an'ny fanehoan-kevitry ny RT-qPCR, manafoana ny fizotran'ny fanadiovana RNA mandany fotoana sy miasa, ary 7 minitra ihany no hahazoana ny môdely RNA ilaina, miaraka amin'ny 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman nomen'ny kitapo dia afaka mahazo vokatra haingana sy mahomby amin'ny PCR tena izy.
5 × Direct RT Mix sy 2 × Direct qPCR Mix-Taqman dia manana fandeferana mahery vaika ary afaka manao famerenana mahomby sy fanamafisana manokana amin'ny fampiasana ny lysate ny santionany ho refesina ho modely.Ny reagent dia misy Foregene Reverse Transcriptase, Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, Reaction Buffer, PCR Optimizer ary Stabilizer, izay azo ampiasaina miaraka amin'ny buffer lysis mba hamantarana haingana sy mora ny santionany, ary manana ny toetran'ny fahatsapana avo lenta, manokana ary fahamarinan-toerana.
Endriky ny vokatra
Ny teknolojia Cell Direct RT tsotra sy mahomby izay maka 7 minitra vao mahazo santionany RNA.
Kely ny fepetra takian'ny santionany, ary sela 10 farafahakeliny no azo ampiasaina hanaovana fanandramana.
Famoahana avo lenta ho an'ny fahazoana RNA haingana amin'ny sela kolontsaina toy ny takelaka 384, 96, 24, 12, ary 6-lavadrano.
Ny ADN Eraser dia afaka manala haingana ireo génome navoaka, izay mampihena be ny fiantraikany amin'ny vokatra andrana manaraka.
Ny rafi-pitantanana RT sy qPCR nohatsaraina dia ahafahan'ny RT-PCR dingana roa miaraka amin'ny fandikana mivadika mahomby kokoa, ny maha-tokana, ary ny fandeferana amin'ny fanoherana RT-qPCR mahery kokoa.
Fampiharana kit
Fampiharana: sela kolontsaina.
Ny lysis santionany dia nandika ny RNA: ampiasaina ho modely RT-qPCR dingana roa fotsiny.
Ny kitapo dia azo ampiasaina amin'ireto tanjona manaraka ireto: famakafakana momba ny fanehoan-kevitra momba ny fototarazo, fitiliana allele, fitiliana zava-mahadomelina, sns.
Famerana kitapo
Sombiny ampitomboina ≤ 300 bp.
Ny kitapo dia ampiasaina amin'ny sela vao kolontsaina.
Fanaraha-maso ny kalitaon'ny vokatra
Araka ny rafi-pitantanana ny kalitaon'ny FOREGENE, ny andiany tsirairay amin'ny kitapo andiany Cell Direct RT-qPCR dia nosedraina imbetsaka mba hahazoana antoka ny fahamendrehana sy ny fahamarinan'ny kalitaon'ny kitapo tsirairay.
Ny votoatin'ny kitapo
QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit-Taqman | ||||
Kit singa20μl qPCR Reaction System | DRT-01021 | DRT-01022 | Fanamarihana | |
200 T | 1000 T | |||
anjara I | Buffer CL | 4 ml | 20 ml |
Lysis sela |
Foregene Protease Plus II | 80l ny | 400 μl | ||
Buffer ST | 400 μl | 1 ml × 2 | ||
anjara II | ADN Eraser | 80l ny | 400 μl | |
5×Mivantana RT Mix * | 160 μl | 800 μl | RT | |
2× Direct qPCR Mix-Taqman * | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 | qPCR | |
20×ROX Reference Fandokoana | 40 μl | 200 μl | ||
RNase-Free ddH2O | 1,7 ml | 10 ml | ||
Boky torolalana | 1 tapa | 1 tapa |
*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman dia azo vidiana misaraka, ny antsipiriany dia omena ao amin'ny Appendix 1 (PEJY 13).
Fepetra fitahirizana
1. Fepetra fandefasana
Ny dingana manontolo amin'ny fitaterana boaty ranomandry amin'ny hafanana ambany, mba hahazoana antoka fa ao amin'ny fanjakana <4 °C ny kitapo.
2. Fepetra fitahirizana
Tehirizo ny ampahany I amin'ny 4 ° C ary ny ampahany II amin'ny -20 ° C.
Ny Foregene Protease Plus II dia tokony hotehirizina amin'ny 4 ° C, fa tsy mangatsiaka amin'ny -20 ° C.
Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman dia tehirizina amin'ny -20°C, na amin'ny 4°C ho an'ny fampiasana fohy raha ampiasaina matetika (ao anatin'ny 10 andro).
Fampahalalana momba ny singa
Buffer CL: Manome ny tontolo iainana ilaina amin'ny fihetsiky ny lysis sela.
Buffer ST: Mamarana ny zavatra mavitrika ao amin'ny lysate mba hisorohana ny fiantraikany amin'ny RT manaraka.
ADN Eraser: ADN manala, vokatry ny fanesorana ny génome amin'ny andrana manaraka.
5× Direct RT Mix: Misy fifandraisana RNA avo Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, ary primer transcription mivadika ho an'ny fampifanarahana tsara indrindra (Random Primer, Oligo(dT)18Primer).
Foregene Protease Plus II: Ao anatin'ny tontolon'ny buffer lysis, ny sela dia lysed mba hamoaka asidra nokleika.
2× Direct qPCR Mix-Taqman: Ity reagent ity dia misy Hot D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, réaction buffer, PCR optimizer, ary stabilizer.
20 × ROX Reference Dye: Matetika ampiasaina amin'ny fitaovana fanamafisam-peo PCR Real Time an'ny ABI, Stratagene ary orinasa hafa, dia ampiasaina hanitsiana ny fahasamihafana misy eo amin'ny fantsona PCR sy ny fantsona vokatry ny fahadisoana PCR dosing.Ny fifantohana 20 × ROX Reference Dye takiana amin'ny fitaovana isan-karazany dia tsy mitovy, ary ny mpampiasa dia afaka manampy azy araka ny tolo-kevitry ny fitaovana.
RNase-Free ddH2O: Rano madio faran'izay madio tsy misy RNase ho an'ny fanehoan-kevitra RT-qPCR dingana roa.
Fisorohana:(Ataovy izay vakiana tsara ny fitandremana alohan'ny hampiasana ilay kitapo)
Tandremo ny fomba fiasan'ny andrana mba hisorohana ny fifandonana eo amin'ny santionany.
Tandremo ny fahadiovan'ny tontolo andrana sy ny fitaovana mba hisorohana ny fandotoana ny RNase sy ny fahasimban'ny ARN.
Makà santionan'ny sela vaovao na voatahiry tsara ary aza mampiasa santionany sela efa natsofoka miverimberina.
5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman dia tokony hialana amin'ny fangatsiahana miverimberina, raha tsy izany dia hisy fiantraikany amin'ny fandikana mivadika sy ny fahombiazan'ny PCR izany.
PrepasakafoTALOHAN'NYhetsika
Aza hadino ny mamaky tsara ny toromarika alohan'ny hampiasana ity kitapo ity.Ny Kit Cell Direct RT-qPCR dia tsotra, mora ary haingana ampiasaina, ary ny torolalana dia manome fampahalalana feno momba ny kitapo manontolo sy ny fomba fampiasana azy io araka ny tokony ho izy.Omano azafady ny fitaovana sy fitaovana andrana ilaina alohan'ny hampiasana azy.
Fitaovana sy fitaovana andrana
◆ Sela kolontsaina.
◆ 1,5 ml na 2 ml, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-Free tip, 0,2 ml sterile qPCR tube.
◆ milina qPCR, pipette, centrifuge tablette (≥13.400×g) (miankina amin'ny filàna andrana), sns.
Fiarovana
◆ Ity vokatra ity dia natao ho an'ny fikarohana siantifika ihany, azafady, aza ampiasaina amin'ny pharmaceutique, klinika, sakafo ary kosmetika.
◆ Rehefa mampiasa zavatra simika, dia mitafy akanjo laboratoara mety, fonon-tanana, solomaso fiarovana, sns.
hetsikampitari-dalana
Ny rafitra Cell Lysis, ny rafitra RT, ary ny fonosana fanampin'ny vahaolana fanehoan-kevitra qPCR dia azo vidiana misaraka, ho an'ny antsipiriany ao amin'ny Appendix 1 (PEJY 13).
Torolàlana momba ny asa
A: Santionany RNA famoahana
1. Notsaboina mialoha ny sela: Sasao amin'ny PBS mangatsiaka ny takelaka kolontsaina sela, avy eo lyse ny sela (10-106), 106 noho ny habetsahan'ny sela, dia soso-kevitra Foregene ny sela sy ny RNA Isolation Kit ny Total (DE-03111) na Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) ho an'ny ARN fitrandrahana sy fanadiovana.
1.1.Ny sela miraikitra (24-plate well ho ohatra)
1.1.1.Farito ny isan'ny sela ao amin'ny lavadrano tsirairay, fantaro fa 1 × 10 ny isan'ny sela5, ary mampiasa pipette hanesorana ny fitaovana kolontsaina amin'ny lovia kolontsaina.
1.1.2.Ampio 200 μl 1 × PBS efa mangatsiaka mialoha ny lavaka tsirairay.Aza manao pipet imbetsaka ary esory ny PBS amin'ny fantsakana.Atsofohy ny takelaka ary esory ny PBS betsaka araka izay azo atao.Tohizo ny dingana 2.
1.1.3.Ny lovia kolontsaina sela isan-karazany na ny latabatra laharana 1-1 ao amin'ny lovia kolontsaina sela dia nampiana 1 × PBS mialoha ny fanadiovana sela.
Table1-1: fatra PBS ho an'ny sela isan-karazany
Karazana takelaka kolontsaina | Isan'ny sela/lava | 1 × PBS / tsara |
6-tsara | 1× 106 | 1000 μl |
12-tsara | 2 × 105 | 400 μl |
24-tsara | 105 | 200 μl |
96-tsara | 104 | 50 μl |
384-tsara | 5 × 103 | 25 μl |
Fanamarihana:Mba hiantohana ny sela miraikitra mafy,betsaka ny fahaverezan'ny sela voasoroka rehefa manasa .
1.2.Ny sela fampiatoana na ny sela miraikitra novolena tao anaty takelaka tsy misy porous
1.2.1.Ny sela adherent kolontsaina amin'ny takelaka tsy misy lavaka fantsakana (sela fampiatoana manomboka amin'ny dingana manaraka 1.2.2), manangona sy manasaraka ny sela araka ny fomba fanangonana sela mahazatra, ary mametraka azy ireo ao anaty takelaka kolontsaina na fantsona centrifuge;raha trypsinization no ampiasaina, dia mitaky centrifugation hanangona ny sela sy hanesorana ny sisa trypsin, nampiana PBS resuspined sela ho any amin'ny tsirairay sela mba hanaparitahana ny sela.
1.2.2.Taorian'ny isan'ny sela voaisa, aliquoted sela 1 × 105 iray amin'ny fantsona centrifuge, manangona sela amin'ny centrifugation amin'ny 1000 × g mandritra ny 10 min.
1.2.3.Ampio 200 μl PBS amin'ny fantsona centrifuge, aza averimberina imbetsaka, ary aspirate mivantana ny PBS.miroso amin'ny dingana 2. (Raha sarotra ny mitete ary averina averina indray ny sela, dia azo atao 1000 × g centrifuged 10 min aorian'ny fanariana ny supernatant, ny pellet sela dia miroso amin'ny dingana 2)
2.Cell lysis: Esory ny Buffer CL, ny mari-pana dia mitovy amin'ny mari-pana amin'ny efitrano, ny ADN Eraser sy ny Foregene Protease Plus II, araka ny tabilao manaraka 1-2 rafitra lysis voaomana: (Voolana Lysis dia vonona hampiasaina).
Table1-2: cleavage fanomanana rafitra (Fanamarihana: amin'ny fanomanana amin'ny ranomandry)
singa fototra (Cell Lysis Master Mix) | 6-lavaka fantsakana | 12-lavaka fantsakana | 24-lavaka lavaka | 96-lavaka lavaka | 384-lavaka lavaka |
1000 μl / lavaka | 400 μl / lavaka | 200 μl / rano | 50 μl / lavaka | 25 μl / lavaka | |
Buffer CL | 960l | 384l | 192μl | 48 μl | 24 μl |
ADN Eraser | 20μl | 8 μl | 4μl | 1μl | 0,5 μl |
Foregene Protease Plus II | 20μl | 8 μl | 4μl | 1 μl | 0,5 μl |
3.( 24 –lavaka fantsakana ohatra) Pipette 200 μl cellule lysis master afangaro ao anaty lavadrano tsirairay, Mitsoka in-5-10, incubate amin'ny mari-pana (20-25 ℃) mandritra ny 5 min.
Fanamarihana:Mba hialana amin'ny fiforonan'ny bubbles, azafady rehefa asiana 200μl na latsaka ny haavon'ny pipetting pipette.Mety ho manjavozavo ny sela aorian'ny lysis, izay mahazatra.
4. (24 –well lovia ho ohatra) dia ampiana ao amin'ny ranon-javatra 20 μl Buffer ST (système lysis isan-karazany Buffer ST nanampy tamin'ny vola aseho ao amin'ny Table 1-3), miverimberina pipetting in-5-10, amin'ny efitra mari-pana (20-25 ℃) dia incubated nandritra ny 2 min.
Fanamarihana:Ny tendron'ny pipette dia nariana teo ambanin'ny tany, mba hahazoana antoka fa nampiana ny lysate,Mba hialana amin'ny fiforonan'ny bubbles, azafady rehefa amboarina amin'ny 200μl na latsaka ny haavon'ny pipetting pipette.
Tabilao 1-3:Ampio ny Buffer ST
Buffer ST | 6- lovia tsara | 12- lovia tsara | 24- lavaka fantsakana | 96- lovia tsara | 384- lavaka fantsakana |
100 μl / lavaka | 40 l/l | 20 μl/l | 5l/l | 2,5 l/l |
5. Ny lysate dia ampiasaina amin'ny fanandramana RT-qPCR manaraka.Raha tsy azo atao ara-potoana ny andrana manaraka, azafady tehirizo amin'ny ranomandry tsy mihoatra ny 2 ora, ary tehirizo ao amin'ny -20 ℃ na -80 ℃ (tsy mihoatra ny telo volana).
B: Fanomanana rafitra RT
1. Esory 5 × Direct RT Mix ary apetraho amin'ny ranomandry, avelao hiempo ho azy, ary afangaro moramora ho an'ny fampiasana aoriana;Esory ny RNase-Free ddH2O dia levona ary apetraho eo amin'ny fandroana ranomandry mba hampiasaina any aoriana.Omano ny rafitra fanehoan-kevitra amin'ny ranomandry araka ny tabilao 2-1 etsy ambany.
Table 2-1: Fanomanana ny rafitra fanehoan-kevitra RT
RT rafitra manampy votoaty | Miaraka amin'ny vola | fifantohana farany | |
5 × Direct RT Mix | 4μl | 8 μl | 1 × |
Lysates sela (modely RNA) | 4 μl | 8 μl | Ampio ny fanitsiana ny elanelana (10 -40%) |
RNase-Free ddH2O | 12 μl | 24 l ny | - |
Volume total | 20 μl | 40 μl | - |
2.After fahavitan'ny rafitra rafitra, moramora mifangaro sy centrifuged vetivety ao amin'ny tabilao manaraka 2 -2 fanehoan-kevitra fepetra RT fanehoan-kevitra.
Tabilao 2-2: Fametrahana fepetra RT
Dingana | hafanana | Time | votoaty |
1 | 42 °C | 15-30 min | synthesis cDNA |
2 | 95 °C | 5 min | Inactivated reverse transcriptase |
3 | 4 °C | N / A |
3. Rehefa vita ny fanehoan-kevitra, ny vokatra fanehoan-kevitra dia napetraka mivantana amin'ny gilasy ho an'ny qPCR, azafady apetraho ny fitehirizana maharitra -20 ℃ na -80 ℃.
Fanamarihana: Noho ny fampiasana môdely tsy voadio dia mety hipoitra ny enta-mavesatra fotsy ao amin'ny vokatra fandikana mivadika.Tranga mahazatra izany.Atsofohy avy hatrany ny supernatant ho an'ny fanandramana manaraka.
Ny valin'ny fanehoan-kevitra RT dia ampiana amin'ny rafitra fanehoan-kevitry ny PCR Step Real Time, soso-kevitra ny hampiditra vola manomboka amin'ny 10-30% amin'ny rafitra fanehoan-kevitra.
C: fiomanana rafitra fanehoan-kevitra qPCR
1. Ny habetsahan'ny B mety voaomana amin'ny dingana cDNA môdely araka ny tabilao manaraka 3-1 hanomanana rafitra fanehoan-kevitra.
Fanamarihana: Ny habetsahan'ny môdely cDNA dia mitentina 10-30% amin'ny rafitra qPCR.Ohatra, amin'ny rafitra qPCR 20μl, ampio 2-6 μl buffer lysis, fa tsy mihoatra ny 6 μl.
2. Ny optimization tsara qPCR fepetra (Annealing maripana, sns) ho an'ny qPCR fanehoan-kevitra (Ny fanehoan-kevitra fepetra omena eo amin'ny Table 3-2).
Fanamarihana: Andramo ny mampiasa fepetra tsara ho an'ny fanehoan-kevitra qPCR mba hahazoana vokatra tsara kokoa.
Tabilao 3-1: Fanomanana ny rafitra fanehoan-kevitra PCR
RT rafitra manampy votoaty | Miaraka amin'ny vola | fifantohana farany |
2× Direct qPCR Mix-Taqman | 10 μl | 1× |
Primer mandroso (10μM) | 0,4 l | 50-900 nM 1* |
Primer mivadika (10μM) | 0,4 l | 50-900 nM 1* |
Probe (10μM) | 0,2 μl | 200nM |
cDNA template (azo amin'ny dingana B) | 4 μl | 10-30% |
RNase-Free ddH2O | - | |
20×ROX Reference Loko 3* | - | - |
Volume total | 20 μl |
1*: Ny fifantohana voalohany dia azo amboarina ao anatin'ny 50-900 nM rehefa ratsy ny fahombiazan'ny fanehoan-kevitra voalohany.
Fanamarihana: Ny rafitra qPCR dia azo amboarina araka ny filàna andrana sy ny modely cycler fluorescence.Ho an'ny qPCR amin'ny 50μl rafitra, amboary ny dosage reagent araka ny 20μl rafitra.
Masinina PCR tena izy | ROX Reference Dye fifantohana farany |
ABI PRISM7000/7300/7700/7900HT / Dingana voalohany, sns. | 1×(oh. rafitra 20 μl, ampio 1 μl 20×ROX Reference Dye) |
ABI 7500/7500 Fast sy StratageneMx3000P/Mx3005P/Mx4000, sns. | 0.5×(oh. rafitra 20 μl, ampio 0.5 μl 20×ROX ReferenceDye) |
2*: Fidio ny fifantohana farany mety amin'ny ROX Reference Dye araka ny fluorescence quantitative thermal cycler.Ny fifantohana ROX Reference Dye mety indrindra ho an'ny cyclers quantitative fluorescence mahazatra dia aseho amin'ny tabilao etsy ambany:
Tabilao 3-2: Ny fepetra fanehoan-kevitra qPCR dia omena
dingana roa- | hafanana | Time | tsingerina | Votoaty |
1 | 95 ℃ | 3 min | 1 | Predenaturation |
2 | 95 ℃ | 5-10 seg | 40 | Denaturation ny maodely |
3 | 60-65 ℃ | 20-30 seg | Fanitarana / fanitarana |
Fanamarihana: Mba hahazoana ny vokatra qPCR tsara indrindra, dia azo ampiasaina ny PCR gradient mba hanamafisana ny toetry ny fanehoan-kevitra ho an'ny maodely samihafa sy ny primers samihafa.Ny toe-javatra fanehoan-kevitra PCR dia miovaova arakaraka ny fluorescence analyzer, môdely, primer, sns. Ao amin'ny fandidiana manokana, ny fepetra fanehoan-kevitra tsara indrindra dia tokony hamboarina araka ny fepetra manokana momba ny fluorescence quantitative thermal cycler, karazana môdely, ny haben'ny sombin-javatra mahaliana, ny filaharan'ny sombintsombiny nohamafisina ary ny votoatin'ny GC sy ny halavan'ny primer, anisan'izany ny mari-pana, ny fotoana fanehoan-kevitra, sns.
Ny tena fotoana PCR fototra famolavolana fitsipika
Primer mandroso sy miverina
Ho an'ny PCR Real Time, ny famolavolana primer dia tena zava-dehibe.Ny Primers dia mifandray amin'ny maha-tokana sy ny fahombiazan'ny PCR amplification, ary azo namboarina miaraka amin'ireto fitsipika manaraka ireto:
◆ Halavany voalohany: 18-30bp.
◆ votoatiny GC: 40-60%.
◆ Sanda Tm: Ny lozisialy fandrafetana voalohany, toy ny Primer 5, dia afaka manome ny sanda Tm an'ny primer.Tokony ho akaiky araka izay azo atao ny sandan'ny Tm an'ny primer ambony sy ambany.Azo ampiasaina koa ny raikipohy kajy Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Rehefa manao PCR, ny mari-pana eo ambanin'ny sandan'ny Tm voalohany amin'ny 5 °C dia voafantina amin'ny ankapobeny ho mari-pana fanalefahana (ny fitomboana mifanaraka amin'ny mari-pana fanalefahana dia mety hampitombo ny fahasamihafan'ny fihetsiky ny PCR).
◆ Primer sy vokatra PCR:
◆ Design primer PCR amplification halavan'ny vokatra dia tsara kokoa 100-150bp.
◆ Tokony hohalavirina araka izay azo atao ny fanamboarana voalohany amin'ny faritra ara-drafitra faharoa amin'ny môdely.
◆ Fadio ny fiforonan'ny fototra mifameno 2 na mihoatra eo anelanelan'ny tendrony 3′ amin'ireo primera ambony sy ambany.
◆ Primer 3′ tobin'ny terminal dia tsy afaka manatrika miaraka amin'ny 3 fanampiny misesy G na C.
◆ Ny primer dia tsy afaka manana rafitra mifameno, raha tsy izany dia hisy firafitry ny volo miforona, izay misy fiantraikany amin'ny fanamafisana ny PCR.
◆ ATCG dia tokony ho zaraina mitovy araka izay azo atao ao amin'ny filaharana voalohany, ary ny 3′ terminal base dia tokony hohalavirina toy ny T.
Fanazavana fanampiny1:Cell DirectRT-qPCR Kit component fonosana fanampiny
1. Vahaolana Lysis Cell
| |||
Kit singa (système lysis / lavadrano 24) | Ampahany DRT-01011-A1 | Ampahany DRT-01011-A2 | |
100 T | 500 T | ||
anjaraaho | Buffer CL | 20 ml | 100 ml |
Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
Buffer ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
anjaraII | ADN Eraser | 400 μl | 1 ml × 2 |
| |
Kit singa (Rafitra fanehoan-kevitra 20 μl) | Ampahany DRT-01011-B1 |
200 T | |
5× Direct RT Mix | 800 μl |
RNase-Free ddH2O | 1,7 ml × 2 |
3.qPCR Mix
| ||
Kit singa (Rafitra fanehoan-kevitra 20 μl) | Ampahany DRT-01021-C1 | Ampahany DRT-01021-C2 |
200 T | 1000 T | |
2× Direct qPCR Mix-Taqman | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
20 × ROX Reference Fandokoana | 40 μl | 200 μl |
RNase-Free ddH2O | 1,7 ml | 10 ml |
World's Foregene
Foregene Co., Ltd
Tel: 028-83360257, 028-83361257
E-mail :info@foregene.com
Http://www.foregene.com