Fantatra tsara fa ao amin'ny dogma afovoany, ny RNA no mpanelanelana transcriptional eo amin'ny ADN sy ny fanehoana proteinina.Raha ampitahaina amin'ny fikarohana ny ADN, ny fahitana ny ARN dia afaka maneho amin'ny fomba tsy miangatra ny fanehoana ny fototarazo ao amin'ny zavamananaina.Ny fanandramana momba ny RNA dia ahitana: qRT-PCR, RNA-Seq, ary ny fusion gene detection, sns. Mifototra amin'ny toetran'ny RNA mihitsy (ny peratra siramamy amin'ny ARN dia manana vondrona hydroxyl maimaim-poana kokoa noho ny peratra siramamy ao amin'ny ADN), miaraka amin'ny RNase maro be ao amin'ny tontolo iainana, ny ARN dia tsy miorina ary mora simba noho ny ADN.Ny fako miditra, ny fako mivoaka, raha tsy tsara ny kalitaon'ny ARN, dia tsy maintsy tsy mahafa-po ny vokatra andrana, miseho manokana ho toy ny angon-drakitra tsy marina na tsy azo averina.Noho izany, tokony hojerena bebe kokoa ny fanodinana ny RNA, ary ny rohy amin'ny fanaraha-maso ny kalitao dia zava-dehibe kokoa mba hiantohana ny fahitsiana sy ny fahamarinan'ny angona andrana manaraka.

Ho an'ny fanaraha-maso ny kalitaon'ny ARN, amin'ny ankapobeny dia misy ireto fomba mahazatra ireto:

• Spectrophotometry
• electrophoresis gel agarose
• Agilent Bioanalyzer
• PCR fluorescent quantitative tena izy
• Qubit fluorescent fomba fandokoana

01 Spectrophotometry

Ny ARN dia manana fatorana roa mifamatotra ary manana tampon'ny absorption amin'ny halavan'ny onjam 260nm.Araka ny lalàn'i Lambert-Beer, dia azontsika atao ny manisa ny fifantohana RNA avy amin'ny tampon'ny absorption amin'ny 260nm.Ankoatr'izay, azontsika atao koa ny manisa ny fahadiovan'ny ARN araka ny tahan'ny 260nm, 280nm ary 230nm absorption peaks.280nm sy 230nm no tampon'ny fisondrotry ny proteinina sy ny molekiola kely.Ny tahan'ny A260 / A280 sy A260 / A230 amin'ny fahadiovan'ny RNA mahafeno fepetra dia tokony ho lehibe kokoa noho ny 2. Raha latsaky ny 2 izany dia midika fa misy proteinina na molekiola kely fandotoana ao amin'ny santionan'ny RNA ary mila diovina indray.Ny loharanom-pahalotoana dia hisy fiantraikany amin'ny andrana midina, toy ny fanakanana ny fahombiazan'ny fampitomboana ny fanehoan-kevitry ny PCR, ka miteraka vokatra tsy marina.Ny fahadiovan'ny ARN dia misy fiantraikany lehibe amin'ny vokatra manaraka, ka ny spectrophotometry amin'ny ankapobeny dia rohy fanaraha-maso kalitao tena ilaina amin'ny dingana voalohany amin'ny fanandramana asidra nokleika.

Sary 1. Karazan'ny RNA/ADN mahazatra

02 Agarose gel electrophoresis

Ankoatra ny fahadiovana, ny fahamendrehan'ny ARN koa dia iray amin'ireo tondro manan-danja amin'ny fitsarana ny kalitaon'ny ARN.Ny fahapotehan'ny RNA dia hitarika amin'ny sombintsombiny fohy marobe ao amin'ny santionany, noho izany dia hihena ny isan'ny sombin'ny RNA izay azo fantarina tsara sy voarakotry ny filaharan'ny reference.Ny fahamarinan'ny ARN dia azo jerena amin'ny alàlan'ny electrophoresis ny totalin'ny ARN amin'ny gel agarose 1%.Ity fomba ity dia afaka manamboatra ny gel amin'ny tenanao manokana, na mampiasa ny rafitra E-Gel™ efa vita mialoha hanaovana fitiliana ny fahamendrehana.Mihoatra ny 80% amin'ny totalin'ny RNA dia ribosomal RNA, ny ankamaroan'izy ireo dia ahitana 28S sy 18S rRNA (amin'ny rafitra mampinono).Ny ARN tsara kalitao dia hampiseho baranjely roa mazava tsara, izay 28S sy 18S bara mamirapiratra, tsirairay avy, amin'ny 5 Kb sy 2 Kb, ary ny tahan'ny dia ho akaiky ny 2: 1.Raha ao anaty fanjakana miparitaka ilay izy, dia midika izany fa mety ho simba ny santionan'ny RNA, ary asaina mampiasa ny fomba voalaza taty aoriana mba hitsapana bebe kokoa ny kalitaon'ny ARN.

Figure 2. Fampitahana ny simba (lane 2) sy ny RNA tsy misy dikany (lane 3) amin'ny electrophoresis gel agarose

03 Agilent Bioanalyzer

Ankoatra ny fomba electrophoresis gel agarose voalaza etsy ambony, izay afaka manampy antsika hamantatra ny fahamendrehan'ny ARN tsotra sy haingana, dia afaka mampiasa ny bioanalyzer Agilent ihany koa isika mba hamaritana ny fahamendrehan'ny ARN.Mampiasa fitambarana microfluidics, electrophoresis capillary, ary fluorescence izy io mba hanombanana ny fifantohana sy ny fahamendrehan'ny RNA.Amin'ny alàlan'ny fampiasana ny algorithm natsangana handinihana ny mombamomba ny santionany RNA, ny bioanalyzer Agilent dia afaka manao kajy ny sandan'ny fahamendrehana RNA, RNA Integrity Number (antsoina hoe RIN) [1].Ny lehibe kokoa ny sandan'ny RIN, ny avo kokoa ny fahamendrehan'ny RNA (1 dia tena simba, 10 no feno indrindra).Ny fanandramana sasany momba ny RNA dia manoro hevitra ny fampiasana RIN ho mari-pamantarana amin'ny fanombanana ny kalitao.Ny famakafakana ny andrana fanazaran-tena avo lenta (antsoina hoe NGS) ho ohatra, ny torolalan'ny Oncomine ™ Human Immune Repertoire, izay ampiasaina hamantarana ny sela B sy ny antigène sela T ao amin'ny Thermo Fisher's Oncomine andian-dahatsoratra, dia manoro hevitra fa ny santionany amin'ny soatoavin'ny RIN mihoatra ny 4, Ny famakiana sy ny clones mahomby kokoa dia azo refesina (sary 3).Misy isan-karazany atolotra ho an'ny tontonana samihafa, ary matetika ny RIN ambony kokoa dia afaka mitondra data mahomby kokoa.

Sary 3, amin'ny andrana Oncomine ™ Human Immune Repertoire, ny santionany miaraka amin'ny RIN lehibe kokoa noho ny 4 dia afaka mahita ny famakiana mahomby kokoa sy ny clones sela T.【2】

Na izany aza, misy fetrany ihany koa ny sandan'ny RIN.Na dia manana fifandraisana avo lenta amin'ny kalitaon'ny angon-drakitra fanandramana NGS aza ny RIN, dia tsy mety amin'ny santionany FFPE izany.Ny santionan'ny FFPE dia notsaboina nandritra ny fotoana ela, ary ny ARN nalaina tamin'ny ankapobeny dia manana sanda RIN ambany.Na izany aza, tsy midika izany fa ny angona mahomby amin'ny fanandramana dia tsy maintsy tsy mahafa-po.Mba hanombanana tsara ny kalitaon'ny santionany FFPE dia mila mampiasa fandrefesana hafa ankoatry ny RIN isika.Ho fanampin'ny RIN, ny bioanalyzer Agilent dia afaka manao kajy ny sandan'ny DV200 ho mari-pamantarana fanombanana ny kalitao RNA.DV200 dia masontsivana izay manisa ny ampahany amin'ny sombiny lehibe kokoa noho ny 200 bp amin'ny santionany RNA.DV200 dia tondro tsara kokoa amin'ny kalitao santionany FFPE noho ny RIN.Ho an'ny ARN nalaina tamin'ny FFPE, dia manana fifandraisana avo dia avo amin'ny isan'ny fototarazo azo fantarina tsara sy ny fahasamihafan'ny fototarazo [3].Na dia afaka manonitra ny tsy fahampian'ny FFPE aza ny DV200, ny bioanalyzer Agilent dia mbola tsy afaka mamakafaka tanteraka ny olana momba ny kalitao amin'ny santionany RNA, ao anatin'izany ny hoe misy inhibitors ao amin'ny santionany.Mety hisy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo amin'ny andrana any amin'ny faritra ambany ny mpanakana ary hampihena ny habetsaky ny angona ilaina.Raha te hahalala raha misy inhibitor ao amin'ny santionany, dia azontsika atao ny manaraka ny fomba PCR fatran'ny fluorescent amin'ny fotoana voafaritra manaraka.

04 PCR fluorescent quantitative tena izy

Ny tena-fotoana fluorescent quantitative fomba PCR dia tsy afaka mamantatra ny inhibitors ao amin'ny santionany, fa koa maneho tsara ny kalitaon'ny ARN ao amin'ny santionany FFPE.Raha ampitahaina amin'ny mpandinika biolojika Agilent, ny fitaovana fatran'ny fluorescence tena izy dia malaza kokoa amin'ny laboratoara biolojika lehibe noho ny fampiharana azy ireo.Mba hitsapana ny kalitaon'ny santionany RNA dia mila mividy na manomana probe voalohany ho an'ny fototarazo anatiny, toy ny GUSB (Cat no. Hs00939627) isika.Amin'ny alàlan'ny fampiasana an'ity andiany voalohany, probe ary fenitra (Total RNA amin'ny fifantohana fantatra) mba hanaovana andrana fatratra tanteraka, ny fifantohana sombin-tsombin'ny RNA mahomby dia azo kajy ho fenitry ny fanombanana ny kalitaon'ny RNA (Functional RNA Quantitation (FRQ) raha fohy).Tamin'ny fitsapana NGS dia hitanay fa ny FRQ an'ny santionany RNA dia manana fifandraisana avo be amin'ny habetsaky ny angona mahomby.Ho an'ny santionany rehetra mihoatra ny 0.2ng/uL FRQ, farafahakeliny 70% amin'ny vakiteny no afaka manarona tsara ny filaharan'ny reference (sary 4).

Figure 4, ny sandan'ny FRQ hita amin'ny fomba quantitative fluorescence dia manana fifandraisana avo be (R2> 0.9) miaraka amin'ny angona mahomby azo amin'ny fanandramana NGS.Ny tsipika mena dia ny sanda FRQ mitovy amin'ny 0.2 ng/uL (log10 = -0.7).【4】

Ho fanampin'ny azo ampiharina amin'ny santionany FFPE, ny fomba PCR fatra amin'ny fotoana tena izy dia afaka manara-maso tsara ny inhibitors amin'ny santionany.Afaka manampy ny santionany ho hita ao amin'ny rafitra fanehoan-kevitra miaraka amin'ny fanaraha-maso anatiny tsara (IPC) sy ny Assay, ary avy eo manao fluorescence quantification mba hahazoana ny Ct sanda.Raha toa ny sandan'ny Ct dia lasa ao ambadiky ny sanda Ct amin'ny fanehoan-kevitra tsy misy santionany, dia manondro fa misy ny inhibitor ao amin'ny santionany ary manakana ny fahombiazan'ny fanamafisana amin'ny fanehoan-kevitra.

05 Qubit fomba fandokoana fluorescent

Qubit Fluorometer no fitaovana kely fampiasa matetika indrindra ho an'ny fifantohana amin'ny asidra nukleika sy ny fahitana ny fahadiovana, izay mora ampiasaina ary misy saika amin'ny laboratoara biolojia molekiola rehetra.Kajy marina tsara ny fitanan'ny asidra nokleika amin'ny alalan'ny fitiliana sy ny loko fluorescent mamatotra asidra nukleika (Qubit detection reagent).Qubit dia manana fahatsapana avo lenta sy manokana, ary afaka manombatombana tsara ny ARN mankany amin'ny pg / µL.Ho fanampin'ny fahaizana fanta-daza amin'ny fanombanana marina ny fifantohan'ny asidra nokleika, ny maodely vaovao farany an'i Thermo Fisher, Qubit 4.0, dia afaka mamantatra ny fahamarinan'ny RNA ihany koa.Ny rafitra fitiliana RNA an'ny Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) dia mahita ny fahamarinan'ny RNA amin'ny alàlan'ny fahitana loko roa miloko fluorescent manokana.Ireo lokon'ny fluorescent roa ireo dia afaka mifatotra amin'ny sombiny lehibe sy sombiny kely amin'ny ARN.Ireo loko fluorescent roa ireo dia manondro ny ampahany betsaka amin'ny RNA amin'ny santionany, ary avy amin'izany ny sanda IQ (Integrity sy Quality) maneho ny kalitaon'ny ARN dia azo kajy.Ny sandan'ny IQ dia azo ampiharina amin'ny santionany FFPE sy tsy FFPE, ary misy fiantraikany lehibe amin'ny kalitaon'ny filaharana manaraka.Raha raisina ho ohatra ny fanandramana NGS, tamin'ny andrana fitsapana RNA-Seq natao tamin'ny sehatra Ion torrent™, ny ankamaroan'ny santionany manana sanda IQ mihoatra ny 4 dia nanana vakiana mahomby 50% farafahakeliny (sary 5).Raha ampitahaina amin'ireo fomba fisavana voalaza etsy ambony, ny Qubit IQ Assay dia tsy vitan'ny hoe mora kokoa ny miasa ary maka fotoana kely kokoa (ao anatin'ny dimy minitra), fa manana fifandraisana lehibe eo amin'ny sandan'ny IQ voarefy sy ny kalitaon'ny data amin'ny fanandramana any ambany.

Figure 5, misy fifamatorana lehibe eo amin'ny sandan'ny Qubit RNA IQ sy ny famakiana sari-tany momba ny RNA-Seq.【5】

Amin'ny alalan'ny fampidirana etsy ambony, mino aho fa ny tsirairay dia manana fahatakarana ampy momba ny fomba fanaraha-maso ny kalitaon'ny ARN.Amin'ny fampiharana dia afaka misafidy ianaony fomba mifanaraka amin'ny karazana santionany sy ny fitaovana efa misy.Amin'ny alalan'ny fanaraha-maso tsara ny kalitaon'ny ARN ihany no ahafahantsika misoroka ny tsy fahombiazan'ny andrana manaraka vokatry ny kalitaon'ny santionany ratsy, ka mamonjy fotoana sarobidy, angovo ary vidiny.

Reference vokatra:

Animal Total RNA Isolation Kit

Kitapo fitokana-monina RNA Total Cell

References

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.Ny RIN: laharan'ny fahamendrehan'ny RNA hanendry ny soatoavin'ny fahamendrehana amin'ny fandrefesana RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Famaritana kalitao nohatsaraina ho an'ny fanombanana ny RNA azo avy amin'ny santionany amin'ny tavy misy paraffin voaraikitra amin'ny arsiva, Siansa misy poizina, Boky 170, pejy 370, 3 Aogositrahttps://doi.org/10.1093/toxsci/