Famolavolana fototra fototra (99% ny olana azo voavaha)
1. Lava voalohany: Ny boky fianarana dia mitaky 15-30bp, matetika eo amin'ny 20bp.Ny tena toe-javatra dia tsara kokoa ny 18-24bp mba hiantohana ny specificity, fa ny ela ny tsara kokoa, ny primer lava loatra dia hampihena ny specificity, ary hampihenana ny vokatra.
2. Ny haavon'ny fanamafisam-peo voalohany: 200-500bp dia mety, ary ny sombiny dia azo nitatra ho 10kb amin'ny fepetra manokana.
3. Primer base: Ny votoatin'ny G + C dia tokony ho 40-60%, kely loatra G + C amplification vokany dia tsy tsara, be loatra G + C dia mora miseho tsy voafaritra tarika.ATGC no tsara indrindra zaraina kisendrasendra, misoroka ny clusters mihoatra ny 5 purine na pyrimidine nucleotides.Multi-gc ho an'ny faran'ny 5′ sy ny filaharana manelanelana mba hampitomboana ny fahamarinan-toerana, misoroka ny GC manankarena amin'ny faran'ny 3′, tsy misy GC ho an'ny toby 3 farany, na tsy misy GC ho an'ny 3 amin'ny toby 5 farany.
4. Halaviro ny rafitra faharoa amin'ny primers, ary misoroka ny famenoana eo amin'ny primer roa, indrindra fa ny famenoana amin'ny faran'ny 3 ', raha tsy izany dia hiforona ny dimer primer ary hipoitra ny tarika tsy voafaritra manokana.
5. Ny fototra ao amin'ny 3 'faran'ny primers, indrindra fa ny farany sy ny farany farany toby, dia tokony ho hentitra miaraka mba hisorohana ny PCR tsy fahombiazana noho ny tsy mpivady toby terminal.
6. Ny primer dia manana na azo ampiana amin'ny toerana cleavage mifanaraka amin'izany, ary ny filaharana kendrena amplified dia tokony hanana toerana cleavage sahaza, izay tena mahasoa amin'ny famakafakana cleavage na kloning molekiola.
7. Ny mampiavaka ny primer: ny primer dia tsy tokony hanana homôlôjia miharihary amin'ny filaharana hafa ao amin'ny angon-drakitra fizotry ny asidra nokleika.
8. Mianara mampiasa rindrambaiko: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Ity endrika an-tserasera ity dia miasa tsara indrindra).
Ny atiny etsy ambony dia afaka mamaha farafahakeliny 99% amin'ny olana momba ny famolavolana primer.
Mifehy ny antsipirian'ny famolavolana primer
1. Lava voalohany
Ny halavan'ny primer ankapobeny dia 18 ~ 30 fototra.Amin'ny ankapobeny, ny zava-dehibe indrindra mamaritra ny mari-pana annealing ny primer dia ny halavan'ny primer.Ny mari-pana annealing ny primer dia voafantina amin'ny ankapobeny (Tm sanda -5 ℃), ary ny sasany mivantana mampiasa Tm sanda.Ireto raikipohy manaraka ireto dia azo ampiasaina amin'ny fanaovana kajy amin'ny ankapobeny ny mari-pana fanalana ny primers.
Raha latsaky ny 20bp ny halavan'ny primer: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Rehefa lehibe kokoa noho ny 20bp ny halavan'ny primer: 62,3 ℃ + 0,41 ℃ (%GC) -500 / halavany-5 ℃
Fanampin'izany, rindrambaiko maro no azo ampiasaina amin'ny kajy ny mari-pana annealing, ny fitsipiky ny kajy dia ho hafa, ka indraindray ny sanda kajy dia mety manana banga kely.Mba hanamafisana ny fanehoan-kevitry ny PCR, ny primer fohy indrindra izay miantoka ny mari-pana tsy latsaky ny 54 ℃ dia ampiasaina amin'ny fahombiazana tsara indrindra sy manokana.
Amin'ny ankapobeny, mitombo amin'ny isa efatra isaky ny nucleotide fanampiny, ka ny halavan'ny primer farany indrindra ho an'ny ankamaroan'ny fampiharana dia 18 nucleotides.Ny fetra ambony amin'ny halavan'ny primer dia tsy dia zava-dehibe loatra, indrindra mifandraika amin'ny fahombiazan'ny fanehoan-kevitra.Noho ny entropy, ny lava kokoa ny primer, ny ambany ny tahan'ny ny anely hamatotra amin'ny ADN kendrena mba hamorona môdely stable tady roa ho an'ny ADN polymerase mba hamatotra.
Rehefa mampiasa rindrambaiko hamolavola primers, ny halavan'ny primer dia azo faritana amin'ny sandan'ny TM, indrindra ho an'ny primer amin'ny PCR quantitative fluorescence, TM = 60 ℃ na mihoatra dia tokony hofehezina.
2. GC votoaty
Amin'ny ankapobeny, ny votoatin'ny G + C amin'ny filaharana voalohany dia 40% ~ 60%, ary ny votoatin'ny GC sy ny sandan'ny Tm amin'ny primers roa dia tokony hifanaraka.Raha toa ka manana fironana A GC na AT matotra ny primer, dia azo ampiana ny rambony A, T na G ary C amin'ny faran'ny 5 'ny primer.
3. Mafana ny mari-pana
Ny hafanan'ny annealing dia tokony ho 5 ℃ ambany noho ny hafanan'ny unchain.Raha kely ny isan'ny fototra fototra, dia azo ampitomboina araka ny tokony ho izy ny mari-pana annealing, izay mety hampitombo ny fahasamihafan'ny PCR.Raha lehibe ny isan'ny fototra, dia azo ahena araka ny tokony ho izy ny mari-pana fanalana azy.Ny fahasamihafan'ny mari-pana amin'ny annealing eo amin'ny 4 ℃ ~ 6 ℃ dia tsy hisy fiantraikany amin'ny vokatra PCR, fa ny tsara indrindra dia ny mari-pana annealing ny mpivady voalohany dia mitovy, izay mety miovaova eo anelanelan'ny 55 ℃ ~ 75 ℃.
4. Halaviro ny faritra rafitra faharoa amin'ny môdely fanamafisam-peo
Ny tsara indrindra dia ny misoroka ny faritra firafitry ny rafitra faharoa amin'ny môdely rehefa misafidy ny sombiny ampitomboina.Ny rafitra faharoa miorina amin'ny sombintsombiny kendrena dia azo vinavinaina sy tombanana amin'ny alàlan'ny rindrambaiko informatika mifandraika amin'izany, izay manampy amin'ny fisafidianana môdely.Ny valin'ny fanandramana dia mampiseho fa matetika tsy mahomby ny fanitarana rehefa latsaky ny 58.6lkJ/mol ny angovo malalaka (△G) amin'ny faritra hitarina.
5. Tsy mifanaraka amin'ny ADN kendrena
Rehefa lehibe ny filaharan'ny ADN kendrena nohamafisina, dia mety hifamatotra amin'ny ampahany maro amin'ny ADN kendrena ny primer iray, ka miteraka tarika maromaro miseho ao amin'ny vokatra.Amin'ity indray mitoraka ity dia ilaina ny mampiasa ny fitsapana rindrambaiko BLAST, tranokala:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Select Align two sequences (bl2seq).
Ny fametahana ny filaharana voalohany amin'ny faritra 1 sy ny filaharan'ny ADN amin'ny faritra 2 dia azo ovaina, ary ny BLAST dia manao kajy famenoana, antisense, ary zavatra hafa, ka tsy mila mahatsikaritra ny mpampiasa raha toa ka rojom-pihetseham-po ireo rojo ireo.Azonao atao ihany koa ny mampiditra ny laharan'ny GI raha fantatrao ny laharan'ny GI amin'ny filaharana ao amin'ny tahiry, ka tsy mila mametaka ampahany lehibe amin'ny filaharana ianao.Farany, kitiho ny Align at 3 mba hahitana raha manana toerana mitovy amin'ny ADN ny primer.
6. Terminal voalohany
Ny fiafaran'ny 3 'ny primer no manomboka ny fanitarana, noho izany dia zava-dehibe ny hisorohana ny tsy fifankahazoana manomboka eo.Ny fiafaran'ny 3 dia tsy tokony hihoatra ny 3 G na C misesy, satria izany dia hahatonga ny primer ho diso amin'ny fizotry ny filaharana G+C.Ny fiafaran'ny 3 dia tsy afaka mamorona rafitra faharoa, afa-tsy amin'ny fanehoan-kevitra PCR manokana (AS-PCR), ny fiafaran'ny 3′ amin'ny primer dia tsy azo ampifandraisina.Ohatra, raha ampitomboina ny faritra encoding, ny 3 'faran'ny primer dia tsy tokony ho tapaka amin'ny toerana fahatelo amin'ny codon, satria ny toerana fahatelo amin'ny codon dia mora miharatsy, izay hisy fiantraikany amin'ny maha-tokana sy ny fahombiazan'ny amplification.Rehefa mampiasa primers annexation, jereo ny latabatra fampiasana codon, tandremo ny safidin'ny biolojika, aza mampiasa primers annexation amin'ny faran'ny 3′, ary ampiasao ny primer (1uM-3uM) ambony kokoa.
7. Firafitra faharoa amin'ny primers
Ny primer dia tsy tokony hanana filaharana mifameno, raha tsy izany dia hiforitra amin'ny firafitry ny volo ny primer, ary io rafitra faharoa io dia hisy fiantraikany amin'ny famatorana ny primer sy ny template noho ny sakana steric.Raha ny fitsarana artifisialy no ampiasaina, dia tsy tokony hihoatra ny 3bp ny fototra mifameno tsy tapaka amin'ny primer.Tsy tokony hisy fifamatorana eo amin'ireo primers roa, indrindra fa ny fifandimbiasan'ny 3 'farany dia tokony hialana mba hisorohana ny fiforonan'ny dimer primer.Amin'ny ankapobeny, tsy tokony hisy mihoatra ny 4 fototra mifanesy homolojia na mifameno eo amin'ireo primers.
8. Ampio marika na loci
Ny fiafaran'ny 5 dia tsy misy fiantraikany firy amin'ny fanamafisam-peo manokana ary noho izany dia azo ovaina tsy misy fiantraikany amin'ny fanamafisana manokana.Ny fanovana ny primer 5 'end dia ahitana: manampy toerana famerana anzima;Misy marika biotine, fluorescence, digoxine, Eu3+, sns.Fampidirana ny tranokalan'ny mutation, ny fampidirana sy ny tsy fisian'ny filaharan'ny mutation ary ny fampidirana ny filaharan'ny mpanentana, sns. Ny fototra fanampiny dia hisy fiantraikany bebe kokoa na latsaka amin'ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo ary hampitombo ny mety hisian'ny fiforonan'ny dimer primer, fa ny fanekena sasany dia tsy maintsy atao amin'ny dingana manaraka.Ny filaharana fanampiny izay tsy misy amin'ny filaharana kendrena, toy ny toerana famerana sy ny filaharan'ny mpanentana, dia azo ampiana amin'ny faran'ny 5′ amin'ny primer tsy misy fiantraikany amin'ny maha-tokana azy.Ireo filaharana ireo dia tsy tafiditra ao anatin'ny kajy ny soatoavin'ny Tm voalohany, fa tokony hosedraina amin'ny famenoana sy ny rafitra faharoa anatiny.
9. Subclones
Amin'ny ankamaroan'ny fotoana, ny PCR dia cloning mialoha fotsiny, ary avy eo dia mila mametraka ny sombintsombiny amin'ny vectors isan-karazany isika, noho izany dia mila mamolavola fototra fanampiny ho an'ny hetsika manaraka amin'ny dingana PCR.
Ny filaharana sasany natao ho an'ny subcloning dia voafintina etsy ambany.
Nampiana toerana famerana endonuclease famerana
Ny fampidirana toerana famerana anzima no fomba fampiasa matetika indrindra amin'ny fametahana ny vokatra PCR.Amin'ny ankapobeny, ny cleavage toerana dia enina fototra, ankoatra ny 5 'ny faran'ny cleavage toerana mila manampy 2 ~ 3 fiarovana fototra.Na izany aza, ny isan'ny fototra fiarovana takian'ny anzima samihafa dia tsy mitovy.Ohatra, SalⅠ tsy mila fototra fiarovana, EcoRⅤ mitaky 1 fototra fiarovana, NotⅠ mitaky 2 fiarovana fototra, ary Hind Ⅲ mitaky 3 fiarovana fototra.
LIC dia manampy ny rambony
Ny anarana fenon'ny LIC dia Ligation-Independent cloning, fomba fanao kloning noforonin'i Navogen manokana ho an'ny ampahany amin'ny vector pET.Ny mpitatitra pET nomanina tamin'ny fomba LIC dia manana tady tokana tsy mifameno 12-15 fototra, izay mameno ny tendrony mipetaka mifanandrify amin'ny sombintsombin'ny kendrena.Ho an'ny tanjona fanamafisana, ny filaharan'ny 5′ voalohany amin'ny sombintsombiny dia tokony hameno ny vector LIC.Ny hetsika extranect 3′→5′ an'ny T4 ADN polymerase dia afaka mamorona tady tokana mipetaka eo amin'ilay sombintsombiny ao anatin'ny fotoana fohy.Satria ny vokatra dia tsy azo niforona afa-tsy avy amin'ny annealing ny voaomana insert sombintsombiny sy ny vector, ity fomba ity dia tena haingana sy mahomby, ary izany no nitarika cloning.
Tanjona TA clone manampy rambony
Ny TA kloning dia tsy afaka nikendry ny sombintsombiny ho lasa vector, ka taty aoriana Invitrogen dia nampiditra vector izay mety mikendry ny kloning, izay misy fototra efatra lehibe GTGGS amin'ny lafiny iray.Noho izany, amin'ny famolavolana ny PCR primers, dia tokony ampiana filaharana mifameno mifanaraka amin'izany, mba hahafahan'ireo sombiny "mitodika".
Raha toa ka fohy ny fotoana dia azonao atao ny manandrana synthesis mivantana, manambatra ny fototarazo amin'ny vector, izay antsoinay hoe ET synthesis gene amin'ny musecularists.
D. In-Fusion cloning fomba
Tsy mila ligase, tsy mila fanehoan-kevitra lava.Raha mbola misy filaharana amin'ny tendrony roa amin'ny vector linearized dia ampidirina Ao amin'ny famolavolana ny primers, dia ampidirina ao amin'ny solution enzyme in-fusion misy BSA ny vokatra PCR sy ny vector linearized ary apetraka amin'ny mari-pana amin'ny efitrano mandritra ny antsasak'adiny, dia azo atao ny fanovana.Ity fomba ity dia mety indrindra amin'ny fiovam-po lehibe.
10. Atambatra primer
Indraindray, fampahalalana momba ny filaharana voafetra ihany no fantatra momba ny famolavolana primer.Ohatra, raha ny filaharan'ny asidra amino ihany no fantatra, dia azo atao ny manamboatra ny primer mampitambatra.Ny primer fampiraisana dia fifangaroan'ny filaharana samihafa maneho ny mety ho fototry ny fototra rehetra izay manodina asidra amino tokana.Mba hampitomboana ny spécialité, azonao atao ny manondro ny latabatra fampiasana codon mba hampihenana ny fanakambanana araka ny safidin'ny zavamananaina samihafa.Ny Hypoxanthine dia azo ampiarahina amin'ny fototra rehetra mba hampihenana ny mari-pana fanalana ny primer.Aza mampiasa ny fototra natambatra eo amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer satria ny fametahana ireo fototra 3 farany amin'ny faran'ny 3′ dia ampy hanombohana PCR amin'ny toerana tsy mety.Ny fatran'ny primer avo kokoa (1μM hatramin'ny 3μM) dia ampiasaina satria tsy voafaritra manokana amin'ny môdely kendrena ny primers amin'ny fangaro fanampin-javatra maro.
PCR akoraPO
1. Hatrany voalohany
Ny fifantohana amin'ny primer tsirairay dia 0.1 ~ 1umol na 10 ~ 100pmol.Tsara kokoa ny mamokatra vokatra ilaina amin'ny habetsaky ny primer ambany indrindra.Ny fifantohana ambony amin'ny primer dia hiteraka tsy fitoviana sy fanamafisana tsy voafaritra, ary hampitombo ny mety hisian'ny dimer eo anelanelan'ny primer.
2. Fifantohana voalohany
Ny fifantohana amin'ny primer dia misy fiantraikany amin'ny fahamendrehana.Ny fifantohana primer tsara indrindra amin'ny ankapobeny dia eo anelanelan'ny 0.1 sy 0.5μM.Ny fatran'ny primer avo kokoa dia mitarika amin'ny fanamafisana ny vokatra tsy voafaritra.
3. Mafana ny mari-pana ny primer
Ny mari-pamantarana manan-danja iray hafa ho an'ny primer dia ny mari-pana mitsonika (Tm).Izany dia ny mari-pana rehefa 50% amin'ny primers sy ny filaharana mifameno dia aseho ho molekiola ADN misy tady roa.Tm dia takiana mba hametraka PCR annealing mari-pana.Ny tsara indrindra, ny mari-pana fanalana dia ambany ampy mba hiantohana ny fametahana mahomby amin'ireo primer miaraka amin'ny filaharana kendrena, saingy avo be mba hampihenana ny fatorana tsy voafaritra.Ny mari-pana annealing mety amin'ny 55 ℃ hatramin'ny 70 ℃.Ny mari-pana fanalefahana amin'ny ankapobeny dia napetraka 5 ℃ ambany noho ny Tm amin'ny primer.
Misy raikipohy maromaro amin'ny fametrahana Tm, izay miovaova be arakaraka ny raikipohy ampiasaina sy ny filaharan'ny primer.Satria ny ankamaroan'ny raikipohy dia manome sanda Tm tombanana, ny mari-pana fanalana rehetra dia fiaingana ihany.Azo hatsaraina amin'ny alalan'ny famakafakana fanehoan-kevitra maromaro izay mampiakatra tsikelikely ny mari-pana fanalana.Atombohy eo ambanin'ny Tm-5 ℃ tombanana, ary ampitomboy tsikelikely ny mari-pana fanalana amin'ny fiakarana 2 ℃.Ny mari-pana annealing ambony kokoa dia hampihena ny fananganana dimer primer sy ny vokatra tsy voafaritra.Mba hahazoana vokatra tsara indrindra dia tokony hanana sanda Tm eo ho eo ny primer roa.Raha mihoatra ny 5 ℃ ny fahasamihafan'ny Tm amin'ny mpivady voalohany, dia hampiseho fanombohana diso lehibe ny primers amin'ny fampiasana ny mari-pana ambany kokoa amin'ny tsingerina.Raha tsy mitovy ny Tm voalohany, dia apetraho amin'ny 5 ℃ ambany kokoa noho ny Tm ambany indrindra ny mari-pana fanalana azy.Raha tsy izany, mba hampitombo ny spécialité, dia azo atao aloha ny tsingerina dimy amin'ny mari-pana fanalana natao ho an'ny Tm ambony, arahin'ny tsingerina sisa amin'ny mari-pana fanariana natao ho an'ny Tm ambany.Izany dia ahafahan'ny dika mitovy amin'ny ampahany amin'ny môdely haleha ho azo ao anatin'ny fepetra henjana.
4. Primer fahadiovana sy ny fahamarinan-toerana
Ny fahadiovana manara-penitra an'ny primer mahazatra dia ampy ho an'ny ankamaroan'ny fampiharana PCR.Ny fanesorana ny vondrona benzoyl sy isobutylyl amin'ny alàlan'ny desalting dia kely ary noho izany dia tsy manelingelina ny PCR.Ny fampiharana sasany dia mitaky fanadiovana mba hanesorana ireo filaharana tsy feno amin'ny fizotran'ny synthesis.Mitranga ireo filaharana tapaka ireo satria tsy 100% ny fahombiazan'ny simia synthesis ADN.Ity dia dingana boribory izay mampiasa fanehoan-kevitra simika miverimberina satria ampiana ny fototra tsirairay mba hahatonga ny ADN avy amin'ny 3′ ka hatramin'ny 5′.Mety tsy hahomby ianao amin'ny tsingerina roa.Ny primer lava kokoa, indrindra fa ireo fototra mihoatra ny 50, dia manana ampahany betsaka amin'ny filaharana tapaka ary mety mitaky fanadiovana.
Ny vokatra azo avy amin'ny primer dia misy fiantraikany amin'ny fahombiazan'ny simia sy ny fomba fanadiovana.Ny orinasa biopharmaceutical, toy ny Cytology sy Shengong, dia samy mampiasa unit OD farafahakeliny mba hiantohana ny totalin'ny oligonucleoside.Ny primer manokana dia alefa amin'ny endrika vovoka maina.Ny tsara indrindra dia ny famahana ny primer ao amin'ny TE ka ny fifantohana farany dia 100μM.Ny TE dia tsara kokoa noho ny rano deionized satria ny pH-n'ny rano dia asidra matetika ary hahatonga ny hydrolysis ny oligonucleosides.
Ny fahamarinan'ny primer dia miankina amin'ny fepetra fitahirizana.Ny vovoka maina sy ny primer levona dia tokony hotehirizina amin'ny -20 ℃.Primers levona ao amin'ny TE amin'ny concentrations lehibe noho 10μM azo stably voatahiry ao amin'ny -20 ℃ mandritra ny 6 volana, fa tsy azo tehirizina afa-tsy amin'ny efitra mari-pana (15 ℃ ny 30 ℃) latsaky ny 1 herinandro.Ny primer vovoka maina dia azo tehirizina amin'ny -20 C mandritra ny 1 taona farafahakeliny ary amin'ny mari-pana amin'ny efitrano (15 C hatramin'ny 30 C) hatramin'ny 2 volana.
5. Enzymes sy ny fifantohana aminy
Amin'izao fotoana izao, ny polymerase ADN Taq ampiasaina dia ny anzima injeniera fototarazo novolavolain'ny bakteria coliforme.Ny habetsahan'ny anzima ilaina amin'ny fampihenana ny fanehoan-kevitra PCR mahazatra dia eo amin'ny 2.5U (manondro ny totalin'ny 100ul).Raha avo loatra ny fifantohana dia mety hitarika amin'ny fanamafisana tsy voafaritra;raha ambany loatra ny fifantohana dia hihena ny habetsahan'ny vokatra sentetika.
6. Ny kalitao sy ny fifantohana amin'ny dNTP
Ny kalitaon'ny dNTP dia mifandray akaiky amin'ny fifantohana sy ny fahombiazan'ny fanamafisana ny PCR.Ny vovoka dNTP dia granular, ary ny fiovaovany dia very ny asany biolojika raha tsy voatahiry tsara.Ny vahaolana dNTP dia asidra, ary tokony ampiasaina amin'ny fifantohana avo, miaraka amin'ny 1M NaOH na 1M Tris.HCL buffer solution mba hanitsiana ny PH ho 7.0 ~ 7.5, kely ny sub-packaging, fitehirizana mangatsiaka amin'ny -20 ℃.Hanimba ny dNTP ny fandoroana mangatsiaka marobe.Amin'ny fanehoan-kevitra PCR, ny dNTP dia tokony ho 50 ~ 200umol/L.Indrindra indrindra, tokony hojerena ny fifantohana amin'ny DNTPS efatra dia tokony hitovy (fiomanana mole mitovy).Raha tsy mitovy amin'ny hafa ny fifantohan'ny iray amin'izy ireo (ambony na ambany), dia hisy ny tsy fifankahazoana.Ny fifantohana ambany loatra dia hampihena ny vokatra PCR.Ny dNTP dia afaka mitambatra amin'ny Mg2+ ary mampihena ny fitanan'ny Mg2+ maimaim-poana.
7. Modely (gène kendrena) asidra nukleika
Ny habetsahana sy ny haavon'ny fanadiovana ny asidra nukleika maodely dia iray amin'ireo rohy manan-danja amin'ny fahombiazana na ny tsy fahombiazan'ny PCR.Ny fomba fanadiovana ADN nentim-paharazana matetika dia mampiasa SDS sy protease K mba handevonana sy hanary ireo santionany.Ny tena asan'ny SDS dia: mamongotra ny lipida sy ny proteinina amin'ny fonon'ny sela, ka manimba ny fonon'ny sela amin'ny alàlan'ny famongorana ny proteinina membrane, ary manasaraka ny proteinina nokleary ao amin'ny sela, ny SDS dia afaka mitambatra amin'ny proteinina sy ny entona;Ny Protease K dia afaka mi-hydrolyse sy mandevona proteinina, indrindra fa ny histones mifamatotra amin'ny ADN, ary avy eo dia mampiasa phenol sy chloroform solvent organika mba hanesorana proteinina sy singa hafa amin'ny sela, ary mampiasa ethanol na isopropyl alcohol mba hanala ny asidra nokleika.Ny asidra nokleika nalaina dia azo ampiasaina ho modely amin'ny fihetsiky ny PCR.Ho an'ny santionany fitiliana klinika ankapobeny, fomba haingana sy tsotra dia azo ampiasaina handravana sela, lysate pathogens, handevona sy hanesorana proteinina avy amin'ny chromosomes mba hanafaka ny fototarazo kendrena, ary ampiasaina mivantana amin'ny PCR amplification.Ny fitrandrahana môdely RNA dia matetika mampiasa guanidine isothiocyanate na fomba protease K mba hisorohana ny RNase tsy hanimba ny ARN.
8.Mg2+ fifantohana
Mg2+ dia misy fiantraikany lehibe amin'ny maha-tokana sy ny vokatra amin'ny fanamafisana ny PCR.Amin'ny ankapobeny PCR fanehoan-kevitra, rehefa ny fifantohan'ny dNTP isan-karazany dia 200umol/L, ny mety fifantohana Mg2 + dia 1.5 ~ 2.0mmol/L.Mg2 + fifantohana dia avo loatra, ny fanehoan-kevitra specificity nihena, tsy voafaritra manokana amplification mitranga, ambany loatra fifantohana dia hampihena ny asan'ny Taq ADN polymerase, ka mahatonga ny fihenan'ny vokatra fanehoan-kevitra.
Misy fiantraikany amin'ny lafiny maro amin'ny PCR ny ion manezioma, toy ny asan'ny ADN polymerase, izay misy fiantraikany amin'ny vokatra;Ohatra iray hafa ny primer annealing, izay misy fiantraikany manokana.Ny dNTP sy ny môdely dia mifamatotra amin'ny ion manezioma, mampihena ny habetsahan'ny ion magnesium maimaim-poana ilaina amin'ny asan'ny enzyme.Ny fifantohana ion manezioma tsara indrindra dia miovaova ho an'ny mpivady voalohany sy modely, fa ny PCR mahazatra manomboka amin'ny 200μM dNTP dia 1.5mM (fanamarihana: Ho an'ny PCR ara-potoana tena izy, ampiasao ny vahaolana ion magnesium 3 hatramin'ny 5mM miaraka amin'ny probe fluorescent).Ny fifantohana avo kokoa amin'ny ion magnesium maimaim-poana dia mampitombo ny vokatra, fa mampitombo ihany koa ny fanamafisana tsy voafaritra ary mampihena ny fahatokiana.Mba hamaritana ny fifantohana tsara indrindra, ny titration ion magnesium dia natao tamin'ny fitomboan'ny 0.5mM avy amin'ny 1mM ka hatramin'ny 3mM.Mba hampihenana ny fiankinan-doha amin'ny fanatsarana ny ion magnesium dia azo ampiasaina ny polymerase ADN Platinum Taq.Ny polymerase ADN Platinum Taq dia afaka mitazona ny fiasa amin'ny fifantohana ion magnesium midadasika kokoa noho ny polymerase ADN Taq ary noho izany dia mitaky fanatsarana kely kokoa.
9. Fanampiana mampiroborobo ny Pcr
Optimization ny mari-pana annealing, primer famolavolana, ary magnésium ion fifantohana dia ampy ho tena manokana amplification ny ankamaroan'ny môdely;na izany aza, ny maodely sasany, anisan'izany ireo manana votoaty GC avo lenta, dia mitaky fepetra fanampiny.Ny additives izay misy fiantraikany amin'ny mari-pana mitsonika ny ADN dia manome fomba iray hafa hanatsarana ny fahasamihafan'ny vokatra sy ny vokatra.Ilaina ny denaturation feno amin'ny môdely mba hahazoana vokatra tsara indrindra.
Ankoatr'izay, ny rafitra faharoa dia manakana ny fatoran'ny primer sy ny fanitarana ny enzyme.
Ny additives PCR, anisan'izany ny formamide, DMSO, glycerin, betaine, ary PCRx Enhancer Solution, manatsara ny fanamafisana.Ny mekanika azo atao dia ny fampihenana ny mari-pana mitsonika, ka manampy amin'ny fanalefahana ny primers ary manampy amin'ny fanitarana polymerase ADN amin'ny alàlan'ny faritra rafitra faharoa.PCRx Solution dia manana tombony hafa.Ilaina ny fanatsarana ny ion magnesium kely indrindra rehefa ampiasaina miaraka amin'ny Platinum Taq DNA polymerase sy Platinum Pfx DNA polymerase.Noho izany, ny teknika Platinum dia mitambatra amin'ny additive mba hampitombo ny specificity raha mampihena ny fiankinan-doha amin'ny fomba fahatelo, optimization magnesium ion.Ho an'ny vokatra tsara indrindra, ny fifantohana amin'ny additives dia tokony ho tsara indrindra, indrindra ny DMSO, formamide, ary glycerol, izay manakana ny polymerase Taq DNA.
10. Manomboka mafana
Ny PCR fanombohana mafana dia iray amin'ireo fomba manan-danja indrindra hanatsarana ny spécialité PCR ankoatry ny famolavolana primer tsara.Na dia 72 ℃ aza ny mari-pana elongation tsara indrindra amin'ny polymerase Taq DNA, dia mijanona ho mavitrika amin'ny mari-pana efitrano ny polymerase.Noho izany, vokatra tsy voafaritra dia novokarina rehefa ambany ny mari-pana fihazonana noho ny mari-pana annealing mandritra ny fanomanana ny fihetsiky ny PCR sy ny fiandohan'ny tsingerin'ny thermal.Rehefa miforona dia ampitomboina tsara ireo vokatra tsy voafaritra ireo.Ny PCR manomboka mafana dia mandaitra indrindra rehefa voafetra ny toerana misy ireo singa fototarazo ireo toerana ampiasaina amin'ny famolavolana voalohany, toy ny fiovan'ny toerana, ny kloningan'ny fiteny, na ny fananganana sy fanodinkodinana ireo singa fototarazo ampiasaina amin'ny injeniera ADN.
Ny fomba mahazatra hamerana ny asan'ny Taq DNA polymerase dia ny fanomanana vahaolana amin'ny PCR amin'ny ranomandry ary mametraka izany ao anaty fitaovana PCR efa nafanaina mialoha.Ity fomba ity dia tsotra sy tsy lafo, fa tsy mamita ny asan'ny enzyme ary noho izany dia tsy manala tanteraka ny fanamafisana ny vokatra tsy voafaritra.
Ny fanamainana mafana dia manemotra ny famotehana ADN amin'ny alàlan'ny fanakanana singa tena ilaina mandra-pahatongan'ny fitaovana PCR amin'ny mari-pana denaturation.Ny ankamaroan'ny fomba fanombohana mafana amin'ny tanana, anisan'izany ny fanemorana ny fampidirana Taq DNA polymerase, dia sarotra, indrindra ho an'ny fampiharana avo lenta.Ny fomba fanamainana mafana hafa dia mampiasa ampinga savoka mba hamehezana singa tena ilaina, ao anatin'izany ny ion magnesium na anzima, na hanokana ara-batana ireo singa mihetsika, toy ny template sy buffers.Mandritra ny tsingerin'ny hafanana dia avoaka sy mifangaro miaraka ireo singa isan-karazany rehefa mitsonika ny savoka.Tahaka ny fomba fanombohana mafana amin'ny tanana, ny fomba fiarovana amin'ny savoka dia sarotra sy mora voan'ny loto ary tsy mety amin'ny fampiharana avo lenta.
Platinum ADN polymerase dia mety sy mahomby amin'ny PCR fanombohana mafana.Platinum Taq DNA polymerase dia misy polymerase Taq DNA recombinant miaraka amin'ny antibody monoclonal manohitra ny polymerase ADN Taq.Ny antibody dia novolavolain'ny PCR mba hanakanana ny asan'ny enzyme mandritra ny fihazonana hafanana maharitra.Taq DNA polymerase dia navotsotra tamin'ny fanehoan-kevitra nandritra ny insulation 94 ℃ ny dingana denaturation, namerina ny hetsika polymerase feno.Mifanohitra amin'ny polymerase Taq DNA novaina simika ho an'ny fanombohana mafana, ny enzyme Platinum dia tsy mitaky insulation maharitra amin'ny 94 ℃ (10 hatramin'ny 15 minitra) mba hampavitrika ny polymerase.Miaraka amin'ny PlatinumTaq DNA polymerase, ny 90% amin'ny hetsika Taq DNA polymerase dia naverina tamin'ny laoniny taorian'ny 2 minitra tamin'ny 94 ℃.
11. Nest-PCR
Ny fihodinana fanamafisam-peo misesisesy amin'ny fampiasana primers nested dia afaka manatsara ny maha-tokana sy ny fahatsapana.Ny fihodinana voalohany dia fanamafisam-peo mahazatra amin'ny tsingerina 15 ka hatramin'ny 20.Ny ampahany kely amin'ny vokatra fanamafisam-peo voalohany dia nolevonina in-100 hatramin'ny 1000 ary nampiana tamin'ny fihodinana faharoa tamin'ny amplification nandritra ny 15 hatramin'ny 20 cycles.Raha tsy izany, ny vokatra amplified voalohany dia azo habe amin'ny fanadiovana gel.Ny primer misy akany dia ampiasaina amin'ny fihodinana faharoa amin'ny fanamafisam-peo, izay afaka mamatotra ny filaharana kendrena ao anatin'ilay voalohany voalohany.Ny fampiasana PCR nested dia mampihena ny mety hanamafisana ny toerana kendrena maro satria vitsy ny filaharana kendrena mifameno amin'ireo andiany voalohany.Ny fitambaran'ny isan'ny tsingerina (30 hatramin'ny 40) miaraka amin'ireo primers mitovy dia nampitombo ny toerana tsy voafaritra.Ny PCR nested dia mampitombo ny fahatsapan'ny filaharana kendrena voafetra (oh: mrnas tsy fahita firy) ary manatsara ny maha manokana ny PCRS sarotra (oh 5′ RACE).
12. Midina PCR
Ny fidinan'ny PCR dia manatsara ny maha-tokana amin'ny fampiasana fepetra fanerena mafy ho an'ny tsingerina PCR vitsivitsy voalohany.Ny tsingerina dia manomboka amin'ny mari-pana annealing eo ho eo amin'ny 5 ℃ ambony noho ny tombanana Tm, avy eo ny tsingerina tsirairay dia nihena 1 ℃ hatramin'ny 2 ℃ mandra-annealing mari-pana ambanin'ny Tm 5 ℃.Ny môdely alehana manana homolojia avo indrindra ihany no hamafisina.Ireo vokatra ireo dia mitohy mivelatra amin'ny tsingerina manaraka, mameno ny vokatra tsy voafaritra.Ny fidinan'ny PCR dia ilaina amin'ny fomba tsy fantatra ny haavon'ny homolojia eo anelanelan'ny voalohany sy ny môdely kendrena, toy ny fanondro amin'ny rantsantanana ADN AFLP.
Ireo singa mifandraika amin'ny PCR
PCR Easyᵀᴹ (miaraka amin'ny loko)
Ny 2× PCR HeroTMNy rafitra Mix dia manana fandeferana avo kokoa amin'ny PCR inhibitors noho ny rafitra PCR Mix mahazatra, ary afaka miatrika mora foana ny fanamafisana PCR amin'ny maodely sarotra isan-karazany.Ny rafitra fanehoan-kevitra tsy manam-paharoa sy ny Taq Hero avo lenta dia mahatonga ny fanehoan-kevitry ny PCR hanana fahombiazana ambony kokoa, manokana ary fahatsapana.
PCR Heroᵀᴹ (miaraka amin'ny loko)
Fahombiazan'ny amplification ambony kokoa
Manana hetsika polymerase ADN 5'→3' izy ary hetsika exonuclease 5'→3', tsy misy hetsika exonuclease 3'→5'.
PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit amin'ny fotoana tena izy
Ny buffer spécific-optimized sy ny enzyme Taq manomboka mafana dia afaka manakana ny fanamafisana tsy voafaritra sy ny fananganana dimer primer
Sarobidy avo—afaka mamantatra ireo dika mitovy amin'ny môdely
RT-PCR Easyᵀᴹ I (dingana iray)
Ny kitapo dia mampiasa reagent foregene reverse transcription tokana sy Foregene HotStar Taq DNA Polymerase miaraka amina rafitra fanehoan-kevitra tokana mba hanatsarana ny fahombiazan'ny amplification sy ny maha-tokana ny fanehoan-kevitra.
Fotoana fandefasana: May-09-2023
