Ny fanandramana RT-qPCR dia ahitana ny fitrandrahana RNA sy ny fanombanana ny kalitao, ny transcription mivadika ary ny qPCR dingana telo, ny dingana tsirairay dia misy fitandremana be dia be, hampahafantatra amin'ny antsipiriany eto ambany.

Ⅰ.fanombanana ny kalitaon'ny RNA

Ao amin'ny fanandramana RT-qPCR, aorian'ny fahavitan'ny fitrandrahana RNA, dia mila tombanana ny kalitaon'ny RNA, ary ny fanandramana fanaraha-maso dia tsy azo atao afa-tsy rehefa mahafeno fepetra.Ny fomba fanombanana dia misy ny spectrophotometer, ny electrophoresis gel Agilent, ny famakafakana Agilent 2100, anisan'izany ny spektrofotometera ampiasaina matetika indrindra ary ny fomba fitiliana electrophoresis gel agarose.Marihina fa ireo fomba roa ireo dia mila ampiasaina miaraka mba hamitana ny fitadiavana sy ny famakafakana ny fifantohan'ny ARN, ny fahadiovana ary ny fahamendrehana, mba hiantohana ny kalitaon'ny ARN.

Kit mitoka-monina RNA mifandraika: 

Kitapo fitokana-monina RNA Total Cell

Ny totalin'ny ARN tena voadio sy avo lenta dia azo avy amin'ny sela kolontsaina isan-karazany ao anatin'ny 11min.

Animal Total RNA Isolation Kit

Manala haingana sy mahomby ny RNA totalin'ny fahadiovana sy kalitao avo lenta avy amin'ny tavy biby isan-karazany.

Spectrophotometer:

Ny spectrophotometer dia ampiasaina indrindra hamaritana ny fifantohana sy ny fahadiovan'ny ARN, saingy tsy afaka mamantatra ny fahamendrehan'ny ARN sy ny sisa tavela.Anisan'izany ny A260/280 sy A260/230 dia masontsivana manan-danja amin'ny fitiliana ny fahadiovan'ny ARN, ary ny fahadiovan'ny ARN dia azo jerena araka ny fiovaovan'ny sandany:

1. 1.9< A260/280< 2.1, milaza fa tsara ny fahadiovan'ny ARN;A260/280<1.9, manondro fa mety hisy proteinina tavela ao amin'ny ARN;A260 / 280> 2.1, manondro ny mety ho fahasimban'ny ampahany amin'ny ARN, izay azo hamafisina bebe kokoa amin'ny alàlan'ny electrophoresis gel agarose.

2. 2.0< A260/230< 2.2, milaza fa tsara ny fahadiovan'ny ARN;A260/230< 2.0, izay manondro fa mety hisy sisa tavela amin'ny reagents organika ao amin'ny ARN, toy ny phenols, ethanol na siramamy.

Agarose gel electrophoresis:

Ny fandinihan'ny electrophoresis gel agarose dia afaka manadihady ny fahamendrehan'ny ARN, ny fototarazo ary ny sisa tavela amin'ny proteinina, saingy tsy afaka manombatombana tsara ny fifantohan'ny RNA na mamantatra ny sisa tavela amin'ny reagents organika.Raiso ohatra ny template RNA eukaryotic:

1. Ny ARN dia niharan'ny electrophoresis gel agarose.Raha misy tarika telo tokana misy 28sRNA, 18sRNA ary 5.8sRNA eo amin'ny sarintany gel, dia midika izany fa tsy misy dikany ny ARN nalaina.Raha misy tranga mitaritarika, dia manondro ny fahasimban'ny ampahany amin'ny ARN izany.

2. Raha misy tarika mamirapiratra tokana eo anelanelan'ny lavaka lakaoly sy ny tarika 28sRNA, dia mety hisy sisa tavela amin'ny ADN.

3. Raha misy fatorana miseho ao amin'ny lavaka lakaoly, dia manondro fa mety hisy sisa tavela amin'ny proteinina sy ny akora macromolecular hafa.

Ⅱ. Mivadika transcription

Rehefa vita ny fitrandrahana RNA dia mila avadika ho cDNA izany ho an'ny fanandramana manaraka, noho izany dia ilaina ny dingana fanodinana.Ny transcription mivadika dia ampidirina amin'ny fisafidianana ny transcriptase mivadika sy ny primer:

Safidy transcriptase mivadika:

Ny transcriptase mivadika mahazatra dia misy AMV RTase sy MMLV RTase.Ny RNase H amin'ny AMV RTase dia manana hetsika mahery vaika, halavan'ny synthesis fohy, habetsaky ny synthesis ambany ary fitoniana mafana tsara (42 ~ 55 ℃).Ny asan'ny RNase H an'ny MMLV RTase dia malemy, ny halavan'ny synthesis dia lava, ny habetsahan'ny synthesis dia avo, ary ny tsy fahampian'ny hafanana mafana (37 ~ 42 ℃).

Satria ny enzyme RNase H dia manana asa manimba ny RNA template, ny MMLV miaraka amin'ny hetsika RNase H malemy dia tokony hofidina manokana mandritra ny transcription mivadika, ary aorian'ny engineering génétique taty aoriana, ny fahamarinan-toerana mafana amin'ny MMLV dia tonga amin'ny fiakarana kalitao.Maka ForegeneForeasy Reverse Transcriptase (M-MLV ho an'ny transcription mivadika) Ohatra, izy io dia transcriptase mivadika vaovao aseho amin'ny bakteria E. coli engineered amin'ny fampiasana teknolojia recombination génétique.Izy io dia polymerase ADN recombinant izay manambatra tady ADN mifameno avy amin'ny ARN, ADN, na RNA: hybrid ADN.Tsy misy hetsika RNase H, fahamarinan-toerana matanjaka, fifandraisana matanjaka amin'ny RNA, ary fahatsapana avo lenta.

 

Foreasy Reverse Transcriptase (M-MLV ho an'ny transcription mivadika)

Fifidianana ny primer:

Amin'ny ankapobeny, ny primer RT dia mizara ho sokajy telo: oligo dT, primer kisendrasendra, ary primer manokana momba ny fototarazo.Misafidiana primer sahaza hampiasaina araka ny fepetra andrana samihafa.

1. Raha avy amin'ny eukaryotic ny môdely ary ny cDNA tara dia ampiasaina amin'ny fanamafisam-peo PCR mahazatra, Oligo (dT) no soso-kevitra;Raha toa ka ampiasaina amin'ny qPCR ihany ny fanandramana manaraka, ny Oligo (dT) dia asaina mifangaro amin'ny primer kisendrasendra mba hanatsarana ny fahombiazan'ny transcription mivadika.

2. Raha avy amin'ny prokaryotes ny môdely dia tokony hofantenana ny Primers Random na ny fototarazo manokana ho an'ny fandikana mivadika.

Ⅲ.qPCR

Ny fandrefesana fluorescence dia nohazavaina indrindra amin'ny fisafidianana ny fomba fatra, ny fitsipiky ny famolavolana primer, ny fifantenana ROX, ny fanamafisana ny rafitra fanehoan-kevitra ary ny toetry ny toe-javatra, sns.

Fifidianana fomba quantitative:

Ny fomba quantitative dia mizara ho fomba quantitative sy fomba quantitative tanteraka.Azo ampiasaina hamantarana ny fiantraikan'ny fomba fitsaboana sasany amin'ny fanehoana ny fototarazo, ny hamantatra ny fahasamihafan'ny fanehoana fototarazo amin'ny fotoana samihafa ary ny fampitahana ny fahasamihafan'ny fanehoana fototarazo amin'ny tavy samihafa.Ny fandrefesana tanteraka dia afaka mamantatra ny habetsahan'ny asidra nokleika ao amin'ny viriosy sy ny sisa.Rehefa manao andrana isika dia tsy maintsy misafidy ny fomba fatra mifanaraka amin'ny andrana ataontsika.

Fitsipika fototra famolavolana:

Ny famolavolana ny primer ho an'ny qPCR dia mifandray mivantana amin'ny fahombiazan'ny amplification sy ny vokatra manokana.Noho izany, ny famolavolana tsara ny primer tsara no dingana voalohany amin'ny qPCR mahomby.Amin'ny famolavolana ny primer, ireto fitsipika manaraka ireto dia tokony hodinihina rehefa mahafeno ny fitsipiky ny famolavolana primer mahazatra:

1. Ny halavan'ny sombintsombiny kendrena dia voafehy eo anelanelan'ny 100 sy 300 bp;

2. Famolavolana cross-exon mba hisorohana ny fiantraikan'ny ADN génomika;

3. Mila sedraina amin'ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo ny primer namboarina, ary rehefa mahatratra ny fenitra (90-110%) ny fahombiazan'ny fanamafisam-peo dia azo ampiasaina amin'ny fanandramana quantitative;

4. Ny fifantohana voalohany dia atao tsara indrindra eo anelanelan'ny 0.1uM sy 1.0uM.

Fifidianana nyROX:

Ao anatin'ny dingan'ny fanehoan-kevitra be dia be, ny ROX dia afaka manitsy ny fahasamihafan'ny lalana optique, ny fahadisoana pipetting na ny fahasamihafan'ny habetsahana vokatry ny etona sy ny condensation amin'ny fomba mitovy, manatsara ny famerenana ny vokatra.Na izany aza, tokony ho marihina fa ny fifantenana ny ROX dia mifandray amin'ny fitaovana.Raha ny fitaovana qPCR dia manana asa manitsy ho azy ny fahasamihafana eo amin'ny lavaka, tsy mila manampy ROX;raha tsy izany dia mila ampiana fanitsiana ROX.Ny mpiara-miasa kely amin'ny fividianana reagents dia tsy maintsy mifanaraka amin'ny fitaovana ampiasaina hisafidianana ny ROX marina, hisorohana ny fahadisoana any aoriana.

Fanomanana ny rafitra fanehoan-kevitra:

Ny habetsahan'ny fanehoan-kevitra 20ul sy 50ul no tiana.Ireto manaraka ireto dia tokony hojerena rehefa mamolavola ny rafitra:

1. Ny rafitra fanehoan-kevitra dia mila omanina amin'ny alàlan'ny rivotra ao amin'ny dabilio tena madio, ddH vaovao₂O dia ampiasaina isaky ny andrana;

2. Ny fanandramana tsirairay dia mila manomana ny NTC hanamarina raha misy ny loto ao amin'ny rafitra, ary ny mpivady voalohany dia mila manao NTC rehefa manomana ny rafitra;

3. Mba hahitana raha misy sisa tavela amin'ny gDNA ao amin'ny môdely RNA, dia azo omanina ho an'ny santionany tsirairay ny NRT mba hahitana;

4. Rehefa manomana ny rafitra, dia soso-kevitra ny hanao farafahakeliny 3 famerenana ara-teknika ho an'ny santionany iray;

5. Rehefa cDNA ny môdely, dia asaina manalefaka in-5-10 mba hampihenana ny fiantraikan'ny rafitra transcription mivadika amin'ny fanandramana qPCR.Tsara kokoa ny mandinika ny habetsaky ny môdely amin'ny alàlan'ny gradient, ka ny sandan'ny CT dia latsaka eo anelanelan'ny 20-30;

6. Farito ny isan'ny fanehoan-kevitra ilaina, mitombo 5-10% amin'ny fototry ny isan'ny fanehoan-kevitra, ary kajy ny laharan'ny fanamafisana ny volume;

7, ny rafitra dia voaomana amin'ny fampiasana ny fitsipiky ny premix, mifangaro aorian'ny centrifugation ary miantoka fa tsy misy bubbles;

8, Arak'izay azo atao ny mifidy ny fanohanana consumables.

Ireo singa mifandraika amin'ny RT-QPCR